72 часовая культура лимфоцитов периферической крови g окраска

Содержание

Исследование кариотипа (количественные и структурные аномалии хромосом) по лимфоцитам периферической крови (1 человек)

Цитогенетическое исследование – кариотипирование – является основным методом диагностики хромосомных нарушений и проводится в целях выявления нарушений количества и структуры хромосом. Используется для пренатальной диагностики.

Хромосомные риски
Кариотипирование супругов
Определение хромосомного набора

DNA Test
Karyotyping
Karyotyping Chromosome Analysis

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исследование проводится в состоянии сытости, не рекомендуется сдавать кровь на данное исследование натощак.
Исключить прием антибактериальных препаратов в течение 1 месяца до исследования.

Общая информация об исследовании

Кариотипирование – цитогенетическое исследование, изучение хромосомного набора человека, позволяющее обнаружить отклонения в структуре и числе хромосом. Оно помогает выявить нарушения хромосом, вероятно, не влияющие на здоровье человека, но тем не менее важные для планирования будущей беременности и для здоровья будущего ребенка (патологии плода, аномалии развития).

Кариотип – это полный хромосомный набор клетки человека. В норме он состоит из 46 хромосом, из них 44 аутосомы (22 пары), имеющих одинаковое строение и в мужском, и в женском организме, и одна пара половых хромосом (XY у мужчин и XX у женщин). Каждая хромосома несет гены, ответственные за наследственность. Кариотип 46, ХХ – соответствует нормальному женскому кариотипу, а кариотип 46, XY – это нормальный мужской кариотип. Кариотип остается неизменным в течение всей жизни.

Нарушения хромосомного набора могут являться причиной наследственной патологии, бесплодия, невынашивания беременности, рождения ребенка с различными пороками развития.

Хромосомные аберрации (отклонения от нормы), нарушая баланс наследственных факторов, являются причиной многообразных отклонений в строении и функциях организма, проявляющихся в так называемых хромосомных болезнях. Около 170 из 1000 эмбрионов погибают до рождения, в 40% причиной являются хромосомные нарушения.

Для цитогенетического исследования хромосом чаще всего используют препараты кратковременной культуры крови, реже клетки костного мозга и культуры фибробластов.

Кариотипирование культуры лимфоцитов периферической крови человека – сложное многоступенчатое цитогенетическое исследование, проводится, когда клетки входят в фазу митоза – непрямого деления с тождественным распределением генетического материала между дочерними клетками. Оно включает в себя следующие этапы:

Постановка культуры лимфоцитов, рост клеток в течение 72 часов. (Рост клеток может быть осложнен различными факторами: наличие инфекционных, хронических, простудных заболеваний; прием лекарственных препаратов; диета; прием алкоголя и т. п. Все эти факторы необходимо исключить перед сдачей анализов).
Обработка культур лимфоцитов: колхицинизация, гипотонизация, фиксация.
Приготовление препаратов хромосом на стекле.
Монохромное и дифференциальное окрашивание препарата.
Анализ препаратов (подсчитывается общее количество хромосом, проводится оценка структуры каждой хромосомы). Анализ хромосом осуществляется на высоком разрешении в 600-850 полос (бэндов) под 1000-кратным увеличением.

Различают несколько видов нарушений структуры хромосом:

трисомии – добавление еще одной хромосомы к паре;
моносомии – утрата одной хромосомы из пары;
делеции – утрата участка хромосомы;
дупликации – повторение определенного участка хромосомы;
инверсии – поворот участка хромосомы на 180 градусов;
транслокации – перенос участков хромосомы в новое положение.

Хромосомные аберрации различаются также по принципу регулярности. Регулярные мутации присутствуют при делении каждой клетки или большинства клеток. Они проявляются в момент зачатия плода либо в первые несколько дней беременности. Нерегулярные аберрации появляются в результате негативного воздействия радиации, химических средств и т.д.

Нарушение расхождения хромосом может произойти во время клеточного деления (мейоза). Если такое нарушение происходит в процессе образования сперматозоидов или яйцеклеток, то в половой клетке появляется лишняя хромосома, которая при зачатии будет передана ребенку. В результате она будет присутствовать во всех клетках организма ребенка. Примером трисомии может служить синдром Дауна (лишняя 21-я хромосома) или синдром Патау (трисомия 13-й хромосомы). Также нарушение расхождения хромосом может произойти при первых делениях оплодотворенной яйцеклетки. Например, утрата Х-хромосомы приводит к развитию Х0-синдрома, или синдрома Шерешевского – Тернера. Аномалии, связанные с нарушением расхождения хромосом, встречаются не так часто, поэтому вероятность их повторения в одной и той же семье достаточно мала.

Структурные же нарушения хромосом передаются по наследству, при этом степень семейного риска и дальнейшая передача дефекта от поколения к поколению становится значительно высокой.

Кариотипирование рекомендуют проводить в тех семьях, где есть высокая вероятность рождения ребенка с болезнью, сцепленной с Х-хромосомой. Например, дальтонизм – многие гены, участвующие в процессе цветовосприятия, находятся на Х-хромосоме, что является причиной возникновения дальтонизма у мужчин, а не у женщин, поскольку Х-хромосома у мужчин одна. Следовательно, если женщина носительница гена заболевания, то вероятность данного заболевания у ее сыновей равна 50%. Дочери этой женщины сами будут здоровы, но с вероятностью 50% будут носительницами дефектного гена.

Когда назначается исследование?

Показания для кариотипирования супружеских пар:

мужское бесплодие: тяжелая олигозооспермия, необструктивная азооспермия, тератозооспермия;
первичная аменорея;
привычное невынашивание беременности в первом триместре (2 и более выкидышей);
наличие выкидышей неясного генеза в анамнезе;
случаи мертворождений в анамнезе;
случаи ранней младенческой смертности в анамнезе;
рождение детей с хромосомной аномалией (например, синдромом Дауна);
рождение детей с множественными врожденными пороками развития (МВПР);
планирование ЭКО;
неудачные попытки ЭКО;
прогноз здоровья будущего ребенка.

Показания для кариотипирования детей:

наличие врожденных пороков развития;
умственная отсталость;
задержка психомоторного развития;
задержка психо-речевого развития в сочетании с микроаномалиями;
нарушение или задержка полового развития;
задержка роста;
аномалии пола.

В соответствии с выявленными нарушениями (или их отсутствием) составляется заключение, включающее оценку генетического риска.

Reddy UM, Page GP, Saade GR, et al. Karyotype versus microarray testing for genetic abnormalities after stillbirth. N Engl J Med 2012;367:2185-93.
Murphy KM, Cohen JS, Goodrich A, Long PP, Griffin. CA 2007. Constitutional duplication of a region of chromosome Yp encoding AMELY, PRKY, and TBL1Y: implications for chromosome analysis. J Mol Diagn, 9: 408-413.

Подписка на новости

Оставьте ваш E-mail и получайте новости, а также эксклюзивные предложения от лаборатории KDLmed

источник

72 часовая культура лимфоцитов периферической крови g окраска

Вряд ли найдется кто-то, кто еще ни разу не сдавал кровь из пальца на анализы. Общий анализ крови берут практически при любом заболевании. Так в чем же его диагностическая ценность и какие диагнозы он может подсказать? Разбираем по-порядку.

Основные показатели, на которые врач обращает внимание при расшифровке общего анализа крови — это гемоглобин и эритроциты, СОЭ, лейкоциты и лейкоцитарная формула. Остальные скорее являются вспомогательными.

Чаще всего общий анализ крови назначают, чтобы понять, есть ли в организме воспаление и признаки инфекции, и если да, то какого происхождения — вирусного, бактериального или другого.

Также общий анализ крови может помочь установить анемию — малокровие. И если в крови есть ее признаки — назначают дополнительные анализы, чтобы установить причины.

Еще общий анализ крови назначают, если есть подозрение на онкологический процесс, когда есть ряд настораживающих симптомов и нужны зацепки. В этом случае кровь может косвенно подсказать, в каком направлении двигаться дальше.

Другие показания обычно еще реже.

Сейчас на бланках с результатом анализов в основном используют англ. аббревиатуры. Давайте пройдемся по основным показателям и разберем, что они значат.

Это более детальная информация о тех самых WBC из предыдущего блока.

Лейкоциты в крови очень разные. Все они в целом отвечают за иммунитет, но каждый отдельный вид за разные направления в иммунной системе: за борьбу с бактериями, вирусами, паразитами, неспецифическими чужеродными частицами. Поэтому врач всегда смотрит сначала на общий показатель лейкоцитов из перечня выше, а затем на лейкоцитарную формулу, чтобы понять, а какое звено иммунитета нарушено.

Обратите внимание, что эти показатели обычно идут в двух измерениях: абсолютных (абс.) и относительных (%).

Абсолютные показывают, сколько штук клеток попало в поле зрение, а относительные — сколько эти клетки составляют от общего числа лейкоцитов. Это может оказаться важной деталью — например, в абсолютных цифрах лимфоциты вроде как в приделах нормы, но на фоне общего снижения всех лейкоцитов — их относительное количество сильно выше нормы. Итак, лейкоцитарная формула.

А теперь пройдемся по каждому из этих показателей и разберем, что они значат.

Гемоглобин — это белок, который переносит по организму кислород и доставляет его в нужные ткани. Если его не хватает — клетки начинают голодать и развивается целая цепочка симптомов: слабость, утомляемость, головокружение, выпадение волос и ломкость ногтей, заеды в уголках губ и другие. Это симптомы анемии.

В молекулу гемоглобина входит железо, а еще в его формировании большую роль играют витамин В12 и фолиевая кислота. Если их не хватает — в организме нарушается синтез гемоглобина и развивается анемия.

Есть еще наследственные формы анемии, но они случаются гораздо реже и заслуживают отдельного разбора.

В норме гемоглобин составляет 120−160 г/л для женщин и 130-170 г/л для мужчин. Нужно понимать, что в каждом конкретном случае нормы зависят от лаборатирии. Поэтому смотреть нужно на референсные значения той лаборатории, в которой вы сдавали анализ.

Повышенные цифры гемоглобина чаще всего случаются из-за сгущения крови, если человек излишне потеет во время жары, или принимает мочегонные. Еще повышенным гемоглобин может быть у скалолазов и людей, которые часто бывают в горах — это компенсаторная реакция на недостаток кислорода. Еще гемоглобин может повышаться из-за заболеваний дыхательной системы — когда легкие плохо работают и организму все время не хватает кислорода. В каждом конкретном случае нужно разбираться отдельно.

Снижение гемоглобина — признак анемии. Следующим шагом нужно разбираться какой.

Эритроциты — это красные клетки крови, которые транспортируют гемоглобин и отвечают за обменные процессы тканей и органов. Именно гемоглобин, а точнее — его железо, красит эти клетки в красный.

Нормы для мужчин — 4,2-5,6*10*9/литр. Для женщин — 4-5*10*9/литр. Которые опять-таки зависят от лаборатории.

Повышаться эритроциты могут из-за потери жидкости с потом, рвотой, поносом, когда сгущается кровь. Еще есть заболевание под названием эритремия — редкое заболевание костного мозга, когда вырабатывается слишком много эритроцитов.

Снижении показателей обычно является признаком анемии, чаще железодефицитной, реже — другой.

Норма — 80-95 для мужчин и 80-100 для женщин.

Объем эритроцитов уменьшается при железодефицитной анемии. А повышается — при В12 дефицитной, при гепатитах, снижении функции щитовидной железы.

Повышается этот показатель редко, а вот снижение — признак анемии или снижения функции щитовидной железы.

Повышение значений почти всегда свидетельствует об аппаратной ошибке, а снижение – о железодефицитной анемии.

Это процентное соотношение форменных элементов крови к ее общему объему. Показатель помогает врачу дифференцировать, с чем связана анемия: потерей эритроцитов, что говорит о заболевании, или с избыточным разжижением крови.

Это элементы крови, ответственные за формирование тромботического сгустка при кровотечениях. Превышение нормальных значений может свидетельствовать о физическом перенапряжении, анемии, воспалительных процессах, а может говорить о более серьезных проблемах в организме, среди которых онкологические заболевания и болезни крови.

Снижение уровня тромбоцитов в последние годы часто свидетельствует о постоянном приеме антиагрегантов (например, ацетилсалициловой кислоты) с целью профилактики инфаркта миокарда и ишемического инсульта головного мозга.

А значительное их снижение может быть признаком гематологических заболеваний крови, вплоть до лейкозов. У молодых людей — признаками тромбоцитопенической пурпуры и других заболеваний крови. Так же может появляться на фоне приема противоопухолевых и цитостатических препаратов, гипофункции щитовидной железы.

Это основные защитники нашего организма, представители клеточного звена иммунитета. Повышение общего количества лейкоцитов чаще всего свидетельствует о наличии воспалительного процесса, преимущественно бактериальной природы. Также может оказаться признаком так называемого физиологического лейкоцитоза (под воздействием боли, холода, физической нагрузки, стресса, во время менструации, загара).

Нормы у мужчин и женщин обычно колеблются от 4,5 до 11,0*10*9/литр.

Снижение лейкоцитов – признак подавления иммунитета. Причиной чаще всего являются перенесенные вирусные инфекции, прием некоторых лекарств (в том числе нестероидных противовоспалительных и сульфаниламидов), похудение. Гораздо реже — иммунодефициты и лейкозы.

Самый большой пул лейкоцитов, составляющий от 50 до 75% всей лейкоцитарной популяции. Это основное звено клеточного иммунитета. Сами нейтрофилы делятся на палочкоядерные (юные формы) и сегментоядерные (зрелые). Повышение уровня нейтрофилов за счёт юных форм называют сдвигом лейкоцитарной формулы влево и характерно для острой бактериальной инфекции. Снижение — может быть признаком вирусной инфекции, а значительное снижение — признаком заболеваний крови.

Второй после нейтрофилов пул лейкоцитов. Принято считать, что во время острой бактериальной инфекции число лимфоцитов снижается, а при вирусной инфекции и после неё – повышается.

Значительное снижение лимфоцитов может наблюдаться при ВИЧ-инфекции, при лейкозах, иммунодефицитах. Но это случается крайне редко и как правило сопровождается выраженными симптомами.

Редкие представители лейкоцитов. Повышение их количества встречается при аллергических реакциях, в том числе лекарственной аллергии, также является характерным признаком глистной инвазии.

Самая малочисленная популяция лейкоцитов. Их повышение может говорить об аллергии, паразитарном заболевании, хронических инфекциях, воспалительных и онкологических заболеваниях. Иногда временное повышение базофилов не удается объяснить.

Самые крупные представители лейкоцитов. Это макрофаги, пожирающие бактерии. Повышение значений чаще всего говорит о наличии инфекции — бактериальной, вирусной, грибковой, протозойной. А также о периоде восстановления после них и о специфических инфекциях — сифилисе, туберкулезе. Кроме того может быть признаком системных заболеваниях — ревматоидный артрит и другие.

Если набрать кровь в пробирку и оставить на какое-то время — клетки крови начнут падать в осадок. Если через час взять линейку и замерить, сколько миллиметров эритроцитов выпало в осадок — получим скорость оседания эритроцитов.

В норме она составляет от 0 до 15 мм в час у мужчин, и от 0 до 20 мм у женщин.

Может повышаться, если эритроциты чем-то отягощены — например белками, которые активно участвуют в иммунном ответе: в случае воспаления, аллергической реакции, аутоимунных заболеваний — ревматоидный артрит, системная красная волчанка и другие. Может повышаться при онкологических заболеваниях. Бывает и физиологическое повышение, объясняемое беременностью, менструацией или пожилым возрастом.

В любом случае — высокий СОЭ всегда требует дополнительного обследования. Хоть и является неспецифическим показателем и может одновременно говорить о многом, но мало о чем конкретно.

В любом случае по общему анализу крови практически невозможно поставить точный диагноз, поэтому этот анализ является лишь первым шагом в диагностике и некоторым маячком, чтобы понимать, куда идти дальше. Не пытайтесь найти в своем анализе признаки рака или ВИЧ — скорее всего их там нет. Но если вы заметили любые изменения в анализе крови — не откладывайте визит к врачу. Он оценит ваши симптомы, соберет анамнез и расскажет, что делать с этим анализом дальше.

Мы заметили, что в комментариях очень много вопросов по расшифровке анализов, на которые мы не успеваем отвечать. Кроме того, чтобы дать хорошие рекомендации — важно задать уточняющие вопросы, чтобы узнать ваши симптомы. У нас в сервисе очень хорошие терапевты, которые могут помочь с расшифровкой анализов и ответить на любые ваши вопросы. Для консультации переходите по ссылке.

Исследование кариотипа (количественные и структурные аномалии хромосом) по лимфоцитам периферической крови (1 человек)

Хромосомные риски
Кариотипирование супругов
Определение хромосомного набора

DNA Test
Karyotyping
Karyotyping Chromosome Analysis

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исследование проводится в состоянии сытости, не рекомендуется сдавать кровь на данное исследование натощак.
Исключить прием антибактериальных препаратов в течение 1 месяца до исследования.

Общая информация об исследовании

Постановка культуры лимфоцитов, рост клеток в течение 72 часов. (Рост клеток может быть осложнен различными факторами: наличие инфекционных, хронических, простудных заболеваний; прием лекарственных препаратов; диета; прием алкоголя и т. п. Все эти факторы необходимо исключить перед сдачей анализов).
Обработка культур лимфоцитов: колхицинизация, гипотонизация, фиксация.
Приготовление препаратов хромосом на стекле.
Монохромное и дифференциальное окрашивание препарата.
Анализ препаратов (подсчитывается общее количество хромосом, проводится оценка структуры каждой хромосомы). Анализ хромосом осуществляется на высоком разрешении в 600-850 полос (бэндов) под 1000-кратным увеличением.

Различают несколько видов нарушений структуры хромосом:

трисомии – добавление еще одной хромосомы к паре;
моносомии – утрата одной хромосомы из пары;
делеции – утрата участка хромосомы;
дупликации – повторение определенного участка хромосомы;
инверсии – поворот участка хромосомы на 180 градусов;
транслокации – перенос участков хромосомы в новое положение.

Когда назначается исследование?

Показания для кариотипирования супружеских пар:

мужское бесплодие: тяжелая олигозооспермия, необструктивная азооспермия, тератозооспермия;
первичная аменорея;
привычное невынашивание беременности в первом триместре (2 и более выкидышей);
наличие выкидышей неясного генеза в анамнезе;
случаи мертворождений в анамнезе;
случаи ранней младенческой смертности в анамнезе;
рождение детей с хромосомной аномалией (например, синдромом Дауна);
рождение детей с множественными врожденными пороками развития (МВПР);
планирование ЭКО;
неудачные попытки ЭКО;
прогноз здоровья будущего ребенка.

Показания для кариотипирования детей:

наличие врожденных пороков развития;
умственная отсталость;
задержка психомоторного развития;
задержка психо-речевого развития в сочетании с микроаномалиями;
нарушение или задержка полового развития;
задержка роста;
аномалии пола.

Reddy UM, Page GP, Saade GR, et al. Karyotype versus microarray testing for genetic abnormalities after stillbirth. N Engl J Med 2012;367:2185-93.
Murphy KM, Cohen JS, Goodrich A, Long PP, Griffin. CA 2007. Constitutional duplication of a region of chromosome Yp encoding AMELY, PRKY, and TBL1Y: implications for chromosome analysis. J Mol Diagn, 9: 408-413.

Оставьте ваш E-mail и получайте новости, а также эксклюзивные предложения от лаборатории KDLmed

Тема 2. Методы клинической генетики.

Цитогенетика — область науки, изучающая структуру и функции хромосом. Для этого применяются следующие методы: световая микроскопия, электронная и конфокальная лазерная микроскопия, люминисцентная микроскопия Цитогенетический метод включает исследование кариотипа, определение частоты сестринских хроматидных обменов, частоты и типов аббераций хромосом, исследование полового хроматина.

Объектом исследования служат соматические, мейотические и интерфазные клетки. В различных ситуациях применяется культивирование фибробластов, клеток костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобным объектом является культура лимфоцитов периферической крови. Для этого у консультируемого производится забор 1-2 мл. венозной крови с последующим культивированием ее на фитогемагглютинине в течение 48-72 часов. За 2-3 часа до завершения культивирования используют колцемид (колхицин), который разрушает веретено деления клетки на стадии метафазы (метод метафазных пластинок). Для более детального изучения районов хромосом применяется метод прометафазных пластинок.

На следующем этапе культуру клеток обрабатывают гипотоническим раствором с целью разрушения ядерных мембран. После фиксации клеточной суспензии препарат окрашивают. Для этого используются простые, дифференциальные и флюоресцентные методы окрашивания.

При простом окрашивании возможна групповая идентификация хромосом (выявляются числовые аномалии). Каждая хромосома имеет индивидуальный рисунок при дифференциальном окрашивании, который определяется специфически чередующимися гетеро- и эухроматиновыми последовательностями. К простым методам окрашивания относят Q,G,R, С.

В настоящее время разработаны молекулярно-цитогенетические методы диагностики хромосомных перестроек. Один из них — метод флюоресцентной гибридизации «in situ» (FICH). Он основан на обработке денатурированной хромосомной ДНК специфическими зондами, которые обладают тропизмом к определенным сегментам ДНК. Далее проводится окрашивание флюорохромами. После этого окрашенные хромосомы визуализируются с помощью люминисцентной микроскопии. Метод более информативен по сравнению с простыми и позволяет идентифицировать незначительные по размерам внутри- и межхромосомные перестройки, а также любой вариант известных хромосомных мутаций.

Кариотип человека обозначается как: 46,ХХ – для мужчин, и 46,ХУ – для женщин. Плечи хромосом: «q» — длинное плечо, «p» — короткое. Аномалии хромосом записываются следующим образом:

Необходимо подчеркнуть показания для проведения цитогенетического исследования:

1) наличие случая хромосомного заболевания (ХЗ) в семье, либо подозрение на ХЗ по клиническим проявлениям: множественные микро- и макроаномалии у пробанда, особенно в сочетании с отставанием в психо-речевом и моторном развитии; задержка умственного и физического развития;

2) первичное невынашивание беременности (2 и более спонтанных аборта, либо выкидыша, мертворождения), первичная аменорея, бесплодие у женщин и мужчин, что может быть обусловлено носительством кого-либо из родителей сбалансированных хромосомных перестроек;

3) пренатальная диагностика хромосомной патологии, а также в случае, если у кого-либо из родителей имеет место наличие транслокационного синдрома;

4) подозрение на синдромы с хромосомной нестабильностью (пр.: лейкоз, наследственные анемии, иммунодефицитные состояния);

5) оценка эффективности лечения, прогноза при лейкозах;

способ индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов

Классы МПК:	G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры)
Автор(ы):	Михалевич Людмила Степановна (BY) , Перепецкая Галина Андреевна (BY)
Патентообладатель(и):	Институт генетики и цитологии АН Беларуси (BY)
Приоритеты:

Способ может быть использован в области биологии и медицины. Для проведения лечебных и профилактических мероприятий по раннему выявлению признаков хронического радиационного воздействия введено исследование частоты а) репродуктивно погибших и б) выживших при культивировании потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов. Проводят стерильный забор крови, культивируют лимфоциты периферической крови в течение 72 ч в 15%-ной питательной среде, мазки витально окрашивают раствором 0,1%-ного метиленового синего. Способ позволяет учитывать репродуктивно погибшие клетки, после 2-5 клеточных делений в культуре лимфоцитов. Повышается точность оценки наследственного клеточно-летального эффекта для потомков родительских лимфоцитов, снижается травматичность при заборе крови, сокращается время на выявление отдаленного эффекта действия хронического облучения in vivo на потомство облученных клеток, проводится ранняя диагностика и профилактика радиационных поражений организма. 2 табл.

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов.

Следует отметить, что известны 2 формы гибели лимфоцитов: интерфазная и репродуктивная (или пролиферативная), определяющая наследственный клеточно-летальный эффект. Большинство исследований посвящены изучению интерфазной гибели лимфоцитов [1,2] , в то время как репродуктивную гибель в известных нам публикациях оценивают значительно реже, используя лишь метод клонирования [3] . Последний метод является трудоемким, дорогостоящим, требующим длительного культивирования лимфоцитов (10-14 дней). В то же время репродуктивная гибель характерна для клеток, существенно определяющих специфику лучевой болезни, среди которой лимфопения, инвалюция органов, богатых лимфоидными элементами, гибель стволовых клеток костного мозга и эпителия крипт кишечника [4].

Аналогом данного способа исследования является способ, предназначенный для учета интерфазной гибели клеток тимуса, селезенки и кишечника мышей при действии низких доз радиации [1], основанный на том, что 0,02%-ный раствор эритрозина Б инкорпорируется в мертвые клетки и окрашивает их в красный цвет. Учет эритрозин Б положительных клеток производится путем подсчета их о помощью микроскопа.

В работах других авторов [5,6] при использовании способа дифференциального окрашивания (DISC) была исследована in vitro радиочувствительность лимфоцитов от больных хроническим лимфоцитарным лейкозом. Выделенные лимфоциты периферической крови этих больных облучали, инкубировали в течение 4 суток, а затем способом дифференциальной окраски живых и мертвых клеток определяли гибель клеток. Результаты характеризовались воспроизводимостью как при повторных исследованиях одного образца, так и при исследовании различных образцов от одного больного.

Прототипом данного изобретения может быть способ, предложенный M.Fenech для проведения цитогенетического мониторинга популяций человека [2].

Указанный способ состоит в том, что использовали кровь здоровых доноров, полученную стерильно методом венопункции. После выделения лимфоцитов в градиенте фикол-верографина их витально окрашивали трипановым синим и автоматически подсчитыавали количество жизнеспособных лимфоцитов, после чего их использовали для культивирования. Индивидуальная культура, содержащая 1 млн лимфоцитов на 1 мл питательной среды, включающей 15% объема иноктивированной эмбриональной телячьей сыворотки, ФГА фирмы «Wellcome» в концентрации 5 мкг/мл, инкубировалась при 37 o С в течение 44 часов в атмосфере 10% двуокиси углерода. Затем в культуру вводили цитохолазин Б в концентрации 4,5 мг/мл культуральной смеси. Фиксацию культуры производили на 72-ом часу от начала культивирования абсолютным метанолом в течение 10 минут. Готовили по 2 препарата на культуру и окрашивали по Май-Грюнвальд Гимзой.

Однако данный способ не может быть использован в таком виде, так как он имеет ряд существенных недостатков.

1. Для проведения анализа с помощью описанного способа требуется как минимум 10 мл венозной крови. Столь большие объемы крови для данного анализа можно получить только с помощью достаточно болезненного для детей метода венопункции.

2. С помощью указанного способа может быть проведена только оценка интерфазной гибели лимфоцитов, т.е. жизнеспособности выделенных лимфоцитов до их культивирования.

3. Используемый способ не дает ответа на вопрос о том, как действует радиационный фактор на пролиферативные возможности клеток крови человека.

Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в том, что для проведения лечебных и профилактических мероприятий по раннему выявлению признаков хронического радиационного воздействия введено:
исследование частоты
а) репродуктивно погибших и
б) выживших при культивировании потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов.

Сущность изобретения заключается в следующем:
для индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов ввели стерильный забор крови из пальца, микроскопическое исследование частоты репродуктивно погибших и выживших потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови, и при повышении количества погибших (соответственно, снижения количества выживших) лимфоцитов по сравнению с контрольными осуществляют индикацию наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов.

Способ реализован следующим образом.

Объектом исследования являлась культура лимфоцитов периферической крови 20 детей г. Калинковичи Гомельской области (уровень загрязнения по Cs-137 5 Ки/км 2 ), а также контрольной группы детей и взрослых г. Минска.

Для постановки культуры использовали цельную кровь, полученную из пальца или методом венепункции. Порции крови в стерильных флаконах с гепарином доставляли к месту постановки эксперимента — в стационарный бокс, работу в котором вели с соблюдением всех правил асептики. Культивирование проводили с использованием модифицированного полумикрометода (7).

Удобство метода заключается в том, что для культивирования требуется небольшое, до 0.5 мл, количество цельной крови, которое может быть получено не только методом венепункции, но и из пальца.

Лимфоциты культивировали в течение 72 часов в 15% питательной среде, состоящей из среды RPMI 1640 фирмы «Вектор-Новосибирск», эмбриональной телячьей сыворотки, 0.2% фитогемагглютинина P фирмы «Difco». На 44 часу роста в культуру добавляли блокатор деления цитоплазмы — цитохолазин Б в концентрации 3.0-4.5 мкг/мл. На 72 часу от начала культивирования к 0.3 мл культуральной смеси, необходимой для проведения анализа пролиферативной гибели культуры, добавляли 0.5 мл сыворотки для предотвращения агрегации клеток, осторожно ресуспендировали культуру, добавляли 3-5 капель метиленового синего — индикатора погибших клеток. Через 30 минут окрашенную суспензию клеток наносили на предметное отекло и подсчитывали число метиленположительных интенсивно окрашенных в синий цвет погибших (Мс+) клеток на 100-200 полинуклеарных лимфоцитов, которые легко визуализировались под световым микроскопом о увеличением 20 х 16.5. Число погибших и выживших (неокрашенных) лимфоцитов выражали как процент (%) Мс+ (Мс-) клеток к общему количеству проанализированных клеток, что выражают следующими формулами

где
N о — общее количество проанализированных лимфоцитов;
N — (N+) — число погибших (выживших) лимфоцитов.

Предложенный нами способ позволяет учитывать репродуктивно (пролиферативно) погибшие клетки, после 2-5 клеточных делений в культуре лимфоцитов, исходно полученных у хронически облучаемых. in vivo в течение всего постчернобыльского периода детей, постоянно проживающих в зоне радиоактивного загрязнения. Результаты такого анализа позволяют дать точную оценку наследственного клеточно- летального эффекта для потомков родительских лимфоцитов, которые в условиях цитохолазинового блока характеризуются четкими отличительными признаками. Лимфоциты-потомки имеют в 2-3 раза больший объем клеток и два или более ядра в одной цитоплазме. Таким образом, эти клетки являются морфологически хорошо различимыми, выжившими или погибшими через несколько клеточных делений лимфоцитами- потомками.

Данные табл. 1 и 2 свидетельствуют о том, что использование предложенной модификации, выявляет высокодостоверные различия уровня репродуктивной гибели клеток у детей г. Калинковичи и контрольных групп г. Минска.

Индивидуальное обследование показало статистически значимое повышение исследуемых показателей в опытных образцах по сравнению с контрольными (примерно в 4-5 раз). Количество репродуктивно погибших клеток у детей г. Калинковичи варьировало от 14.0 до 27.0 процентов среди лимфоцитов, претерпевших несколько делений, тогда как в контрольных группах у детей и взрослых эти показатели изменялись от 2.5 до 12.5%.

Анализ среднегрупповых показателей репродуктивной гибели лимфоцитов детей из опытной и двух контрольных групп также подтвердил это заключение: 21.00.6% у детей г. Калинковичи, 5.60.7 и 5.30.8 у детей и взрослых г. Минска. Следует отметить, что выбранные нами контрольные группы являются условно-контрольными, так как радиационно-экологическая обстановка в Минске также изменилась после катастрофы на ЧАЭС.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение о том, что:
1. результаты обследования детей, подвергающихся длительному неконтролируемому многокомпонентному радиационному воздействию разной интенсивности и продолжительности в районах, выпадения радиоактивных осадков, показали высокую эффективность индивидуальной и популяционной биоиндикации облучения по частоте репродуктивной гибели лимфоцитов периферической крови;
2. использование метиленового синего (Мс) позволило провести точный количественный учет живых (Мс-) и погибающих или погибших (Мс+) клеток, которые претерпели несколько делений в условиях цитокинетического блока в культуре лимфоцитов периферической крови;
3. наличие погибших лимфоцитов, находящихся в I, II, III и более клеточных циклах, показало, что после хронического облучения могут погибать не только непосредственно облученные клетки, но и их потомки.

Использование данного способа позволит:
1. по сравнению с венепункцией осуществлять забор крови у детей неинвазивно, снижая нервную и травматическую компоненты;
2. ускорить выявление выживших при культивировании потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови человека;
3. сократить время на выявление отдаленного эффекта действия о хронического облучения in vivo на потомство облученных клеток;
4. оценить косвенно пролиферативные возможности стволовых кроветворных клеток;
5. проводить профилактику и раннюю диагностику с целью выявления радиационных поражений организма.

Источники информации
1. T. Nomura, V.Kinuta, T.Hongyo, H.Nakajima & T.Hatanaka. Prograrnmed Cell Death in Whole Body & Organ Systems by Low Dose Radiation//Radiat. Res. -1992. -33: Supplement.-P. 109-123.

2. M. Fenech. The cytokinesis-block micronucleus technique: A detailed description of the method & its application to genoto-xicity studies in human populations//Mut.Res..- 1993.-285.-P.35-44.

3. Tales, A.D., van Dam, F.J., van Mossel, H., Schoemaker, H.M., Osterman-Golkar, S. , Uebel, Ch., Tang-, Y.S., Zwinderman, A.H. and A.T. NataraJ»an (1991) Use of the clonal assay for the measurement of frequencies of hprt mutants in T-lymphocytes from five control populations. Mutation Res., 253, 199-213. =20
4. Комар B.E., Ханоон К.П. Информационные макромолекулы при лучевом поражении клеток// М.:Атомиздат.-1980.-1760.

5. H. I. Hinkley, A. G. Bosanquet. The in vitro radiosensitivity of lymphocytesfrom chronic lymphocytic leukaemia using the differential staining sytotoxicity (DISC) assay. 1. Investigation of the method// Int. J. Radiat. Biol. -1992.-61, No. I. P. 103-110.

6. A. G.Bosanquet, H.I.Hinkley. Profound differences in the radiosensitivity of lymphocytes from patients with chronic lymp-hocytic leukaemia found by DISCassay: Abstr. sci. presentat. Meet Assoc. Radiat. Res., Cardiff, UK, 16-18 Apr.//Int.J.Radiat.Biol.-1991.-60, No. 6.- p. 947.

7. D.A.Hungerford. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood & the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl//Stain.Techn.-1965.-v. 40.-P. 333-338.

Способ индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов, включающий стерильный забор крови, культивирование лимфоцитов периферической крови в течение 72 ч в 15%-ной питательной среде с 0,2% фитогемагглютинина и добавлением блокатора деления цитоплазмы — цитохолазина Б в концентрации 3 — 4,5 мкГ/мл, витальное окрашивание раствором 0,1%-ного метиленового синего и микроскопирование, отличающийся тем, что стерильный забор крови производят из пальца, а микроскопически исследуют частоту репродуктивно погибших и выживших потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови и при повышении количества погибших (соответственно снижения количества выживших) лимфоцитов по сравнению с контрольными осуществляют индикацию наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови детей из загрязненных радионуклидами районов.

Проблема бесплодия, пожалуй, самая масштабная и многогранная, с которой приходится сталкиваться в своей практике врачу-андрологу. Так устроено, что нормальное созревание полноценных сперматозоидов возможно только в условиях правильного функционирования всех систем жизнеобеспечения организма. Поэтому, сбои в работе одной из них, казалось бы, далекой от половой функции, например, пищеварительной или сердечно-сосудистой, могут негативно сказаться на воспроизводстве потомства. Конечно, существует алгоритм диагностики мужского бесплодия, и в нем ключевую роль играет анализ качества спермы — спермограмма.

Правильно выполненная спермограмма позволяет оценить количество, подвижность спермотозидов, наличие дефектных форм и другие параметры, крайне важные для выявления и интерпретации патологических изменений.

Половое воздержание в течение 3 дней (не менее 2 и не более 5)
За 10 дней до анализа исключить локальное перегревание мошонки (бани, сауны), прием любых лекарственных препаратов, алкоголя
Если вы перенесли простудную инфекцию или любое другое воспалительное заболевание, подождите в течение 2 недель после выздоровления

Интерпретация спермограммы
Нарушения в спермограмме могут выражаться в снижении количества сперматозоидов (олигозооспермия), ухудшении подвижности (астенозооспермия), повышении количества дефектных, патологических форм сперматозоидов (тератозооспермия). Воспалительный процесс в половой системе проявляется повышенным количеством лейкоцитов и бактерий в сперме (пиоспермия) или только лейкоцитов лейкоцитоспермия). Крайним вариантом патологических изменений в спермограмме является азооспермия — полное отсутствие сперматозоидов в сперме, что служит причиной мужского бесплодия. Азооспермия может быть связана с тяжелым поражением сперматогенного эпителия яичек (так называемый секреторный или необструктивный тип азооспермии) или с блоком транспорта сперматозоидов на уровне семявыносящих путей — обструктивный тип азооспермии.

Диагностика бесплодия у мужчин
Как уже отмечалось, ключевым методом оценки репродуктивной функции мужчины является спермограмма. Однако на этом диагностика мужского бесплодия не заканчивается. Для получения полной объективной картины и выявления причин бесплодия или снижения фертильности урологу-андрологу необходимо оценить каждый из компонентов, принимающих участие в процессе образования, созревания и транспорта сперматозоидов. С этой целью может потребоваться УЗИ органов мошонки с исследованием кровотока, обследование предстательной железы и семенных пузырьков (ТРУЗИ простаты, анализ секрета простаты), анализ на “скрытые” инфекции и т.д. Крайне важную роль играет исследование гормонального статуса, так как функция яичек находится в тесной связи с концентрацией и соотношением половых гормонов. При тяжелых изменениях в спермограмме, а также при азооспермии выполняется биопсия яичек.

Биопсия яичек
Биопсия яичек позволяет не только досконально оценить состояние сперматогенной функции яичек и определить вид азооспермии (необструктивный или обструктивный), но и отобрать сперматозоиды (в случае их наличия, конечно) и законсервировать их для последующего использования с целью оплодотворения. Именно поэтому я являюсь сторонником выполнения расширенной биопсии яичек с экстракцией сперматозоидов и проведением их криоконсервации. Данная методика биопсии яичка называется TESE (от англ. testicular sperm extraction, тестикулярная экстракция сперматозоидов) и я обучался ей в Германии у профессора Tim Schneider, в клинике, специализирующейся на лечении мужского бесплодия. Таким образом, биопсия яичка в варианте TESE дает двойной результат: диагностика бесплодия и заготовка сперматозоидов для последующего использования в программах ЭКО/ИКСИ. Биопсия яичка выполняется амбулаторно, под местной или внутривенной анестезией (по желанию пациента). Применение операционного бинокуляра и микрохирургической техники (micro-TESE) повышает эффективность процедуры и шансы на получение достаточного количества сперматозоидов. Отбор и криоконсервация сперматозоидов производится в одной из ведущих клиник-партнеров, занимающихся вспомогательными репродуктивными технологиями.

Подготовка к ЭКО
В случае принятия решения о применении вспомогательных репродуктивных технологий (таких как инсеминация, ЭКО или ИКСИ) при диагнозе бесплодие задача андролога состоит в оптимизации репродуктивной функции мужчины, что позволит повысить эффективность процедуры.

Пожалуйста расшифруйте генетический анализ.
MTHFR1298 результат А/С
MTRR 66 результат А/G
F2 результат G/А
FGB результат G/A
ITGA2-a2 результат C/Т
PAI-1 результат 5а/4а

О себе 24 года, в 21 год первая беременность с осложнениями, гистоз. Могу ли я в будущем при планировании беременности выносить ребенка и родить здорового малыша. Заранее большое спасибо.

Проведено исследование ДНК с целью поиска патогенных
вариантов в гене GJB2, кодирующем белок коннексин 26. Выполнено прямое секвенирование по
Сенгеру экзона 2 гена GJB2 (всей кодируюшей последовательности и прилегающего
экзон-интронного соединения), ПДРФ-анализ мутации сайта сплайсинга c.-23+1G>A
(IVS1+1G>A) в интроне 1 гена GJB2, а также ПДАФ-анализ крупной делеции 101 kb
del(GJB2-D13S175) в локусе DFNB1.
В результате анализа обнаружены рецессивные патогенные варианты c.358_360delGAG
(p.Glu120del) и с.269T>C (p.Leu90Pro) в гетерозиготном состоянии.

Вопросы по анализу. Я ожидала, что мутации найдут в гомозиготном состоянии, а здесь получается в гетерозиготном состоянии. Этого разве достаточно для подтверждения диагноза наследственной тугоухости? Или эти мутации на двух хромосомах — по одной на каждой, так как называемая компаундная гетерозиготность?

Здравствуйте, недавно была операция по удалению замершей беременности (вакуум-аспирация), беременность замерла на 8 неделе — обнаружили на 12 неделе. Делали генетическое исследование плода, заключение: моносомия Х хромосомы.
Беременность была первая. По гистологии и гинекологии все чисто.
Подскажите пожалуйста что означает такой диагноз и какой вид анализа необходимо сдать?
Определение кариотипа с аберрациями

Определение кариотипа без аберрациями

Здравствуйте!
Мне 39 лет. У меня миопия высокой степени (примерно -16 и -19 правый и левый глаз соответственно и на каждом глазу еще небольшой астигматизм). Миопия с детства, в подростковом возрасте делали склеропластику и лазерную коагуляцию сетчатки, но миопия все равно прогрессировала в итоге до нынешних значений, последние 4,5 года неизменная, но незначительно варьируется +-0,5 диоптрий. На осмотре в поликлинике 17.01 врачу не понравилось мое глазное давление (пневмо 23 и 26 правый и левый соответственно); сразу добавлю, что до этого его измеряли мне в 2012 году (пневмо, но это если я правильно помню способ) и было оно тогда 16 и 17 соответственно (это я подняла прошлые обследования). Была направлена на обследование в спец. глазной центр (03.02). Там с назначенными исследованиями возникли некоторые проблемы: 1) на компьютерной периметрии мне очень условно смогли под мои диоптрии подобрать линзы (сделали -12 и -15), через которые я смотрела на «точку», врач. проводившая исследование, сокрушалась, что показания из-за этого не факт, что будут точными, ну и действительно, видела я не очень хорошо, что-то могла пропустить чисто из-за того, что реально не видела + волнение из-за этого. Результат: OD в пределах нормы, OS пограничное значение, снижение светочувствительности. 2) HRT сделать не смогли, т.к. у них макс.на +-12 диоптрий аппарат рассчитан. Что сделали: ORA, гониоскопию и еще что-то смотрели там же, где гониоскопию (биомикроскопия?). По Маклакову не измеряли давление ни разу. Результаты: ORA: правый IOPcc 23,5, IOPg 20,9, WS 4,9, CH 7,8, CRF 9,8; левый IOPcc 27,9, IOPg 27,0, WS 5,2, CH 8,5, CRF 12,3. Гониоскопия: OU УПК открытый гониодисгинез. Экскавация (. ) ДЗН 0,5 DD. Ну и еще хотела добавить (не знаю, насколько это важно, я все время сильно «дергаюсь» при пневмо-измерении давления).
По результатам всего этого обследования был поставлен диагноз ПОУГ 1ab. Начальная стадия, скорее всего врожденная, но раньше не проявлялось (!), а сейчас начали накладываться возрастные изменения и т.п. Рекомендовано применять «Тафлотан» «пожизненно» (с), под контролем разумеется (через 2-3 нед. измерение ВГД и через 4-6 мес. обследование). Про операции и т.п. ничего не говорили.
Собственно, вопрос у меня вот в чем. Можно ли основании этих исследований сказать (например, по ORA), что у меня 100% глаукома, а не, например, офтальмогипертензия в результате каких-то других причин (т.к. последнее время начала проявлять активно разная неврологическая симптоматика и я как раз параллельно планирую заняться обследованием с этой стороны + стрессы)? Или это в некоторой степени «перестраховка» врача (диагноз и назначение капель)?
Дело в том, что не хотелось бы «садиться» на капли хотя бы по той причине, что я теоретически планировала, если получится, родить еще успеть и причем в ближайшее время, т.к. в курсе уже теперь (прочитав инструкцию), что их нельзя применять при планировании беременности и тем более при беременности. Ну и вообще — там есть и др. побочки, которые бы не хотелось испытывать, если есть возможность этого пока избежать.

Еще дополнительно делали после исследований на глаукому компьютерную томографию сетчатки (написали, что есть снижение прозрачности оптических сред, поэтому тоже не очень получилось точным это исследование) осмотр глазного дна линзой Гольдмана (правый глаз — формирующаяся решетчатая дистрофия — наблюдение, левый — решетчатая дистрофия — рекомендовано «приваривание» лазером). Врач, проводивший КТ, сказал, что визуально изменений в зрительном нерве не видел при томографии.

В дополнение:
1. В день обследования в глазном центре (до проведения всех остальных обследований, в т.ч. периметрии и ORA) на пневмо-тонометре было давление OD 20, OS 21. Через пять дней на том же тонометре OD 19,6 OS 23,3 (после РОЗ). Сказали, что у них тонометр «настроен под Маклакова» (?), хотя он и пневмо, вот это я не очень поняла, как так может быть.
2. Толщину роговицы мне отдельно не замеряли, но сказали, что учитывается она при расчете на ORA.
3. Делали еще ОСТ макуларной зоны, ОСТ ЗН не смогли опять же.
4. Врач, поставивший диагноз, еще раз сказал, что настаивает именно на таком диагнозе, а именно: ПОУГ 1ab и на каплях. Т.е. пока такое лечение. Утверждает, что побочек у «Тафлотана» (кроме изменения цвета радужки и роста ресниц) нет (хотя по инструкции это не так) и даже что ничего страшного, если не фоне него наступит беременность (хотя инструкции говорят об обратном) и что потом на время беременности прекратить капли и делать наблюдаться. Некоторые врачи как вариант предлагают динамическое наблюдение (без капель) (без привязки к возможной беременности — как вариант дальнейшей моей тактики).

Очень жду комментариев. Основные вопросы — есть ли необходимость прямо сейчас начинать применять капли, очевиден ли диагноз, нужно ли еще провести дополнительные обследования какие-либо, как мне теперь планировать беременность.

13.02 на пневмо-тонометре (на том, с которого все началось, т.е. где изначально было OD 23, OS 26, когда меня отправили на дополнительное обследование) было OD 20, OS 21.

15.02 удалось сделать ORA еще раз:
OD IOPcc 22,7, IOPg 21,7, WS 7,2, CH 9,2, CRF 11,2; Еще были показания (дописал ручкой врач) 23,1, 24,8; посчитан Kbs min =1,06
OS IOPcc 25,2, IOPg 24,6, WS 6,1, CH 9,1, CRF 12,0; посчитан Kbs =1,16
Биомеханические свойства фиброзной оболочки глаза средние
Еще была попытка сделать OCT зрительного нерва, но как мне сказали, в случае с моей миопией он не точен, т.к. непонятно, из-за чего может быть истончение зрительных волокон (из-за миопии может быть), ну и из-за неидеального хрусталика.

Анализ кариотипа человека проводят в культуре делящихся соматических и половых клеток. Наиболее часто при цитогенетических исследованиях в медицинской генетике используют культуру клеток периферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов. Наиболее доступны для исследований лимфоциты периферической крови, которые, в большинстве случаев и служат объектом цитогенетического анализа у человека в постнатальном периоде. Для анализа кариотипа плода могут быть использованы различные клеточные культуры; их выбор диктуется сроком беременности, в котором проводится исследование. Так, на раннем сроке (до 12 недель внутриутробного развития) анализ хромосом целесообразно проводить в клетках ворсин хориона, в то время как в более позднем сроке цитогенетическому исследованию подвергают клетки плода, выделенные из амниотической жидкости, пуповинной крови и плаценты.

Для исследования кариотипа человека достаточно получить образец периферической крови в количестве 1-2 мл. Цитогенетический анализ включает три основных этапа: 1) культивирование клеток; 2) окраску препарата; 3) микроскопический анализ препарата. Культивирование клеток проводится следующим образом. После забора образец крови помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений — фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток.

Успех цитогенетического исследования в значительной мере определяется тем, сколько клеток в культуре будут находиться в стадии метафазы. Для увеличения количества метафазных клеток за полтора часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин, который разрушает клеточное веретено, приостанавливает деление клеток на стадии метафазы и увеличивает конденсацию хромосом. Обычно, продолжительность культивирования составляет 72 ч. После его окончания клетки с питательной средой центрифугируют и помещают в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. Гипотоническая обработка приводит к разрыву ядерной оболочки и межхромосомных связей и свободному перемещению хромосом в цитоплазме. После этого производится фиксация клеток смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, после чего клеточную суспензию раскапывают на охлажденные влажные предметные стекла и высушивают на воздухе.

На следующем этапе цитогенетического исследования производится окраска препаратов. В зависимости от целей исследования, то есть оттого, какой именно тип перестроек необходимо выявить, можно использовать различные виды окрашивания.

Наиболее простой метод окрашивания хромосом, называемый в настоящее время сплошным или рутинным, применяют для определения количества хромосом в препарате и выявления геномных мутаций и анеуплоидий. При этой окраске используют краситель Гимзы, который равномерно прокрашивает хромосомы по всей длине, что дает возможность идентифицировать хромосомы и оценить их количество в препарате. Этот метод окраски успешно применялся до 70-х годов прошлого века и позволил выявить этиологию большинства хромосомных синдромов, характеризующихся изменением количества хромосом. В настоящее время сплошное окрашивание применяют, в основном, для выявления количественных аномалий кариотипа, а также специфического сайта ломкости при синдроме фрагильной X-хромосомы. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по всей длине, представлен на рисунке.

Однако использование рутинного метода окраски не позволяет выявлять структурные перестройки хромосом. В этих случаях применяют специальные методы, так называемой, дифференциальной окраски, в результате которой хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и толщина темных и светлых полос строго индивидуальны для каждой хромосомы, что позволяет проводить их точную идентификацию и выявлять структурные перестройки. Для объяснения возникновения различно окрашенных полос на хромосомах выдвигается несколько гипотез: различия в количественном содержании А—Т- и G—С-пар оснований, особенности строения нуклеосом, а так же асинхрониость репликации различных участков ДНК.

Наибольшее распространение получил простой и эффективный G-метод дифференциального окрашивания. В этом случае для окрашивания хромосом также используют краситель Гимзы, однако, хромосомы предварительно обрабатывают раствором трипсина. Процедура окрашивания занимает от 5 до 10 минут и приводит к появлению специфичного для каждой хромосомы рисунка поперечной исчерченности. Показано. что количество полос в метафазных и прометафазных пластинках существенно различается: в метафазных пластинках их число достигает 400, а в прометафазных — от 800 до 1000. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по G-методу, представлен на рисунке.

Другие методы окраски используются реже вследствие их сложности или узкой специфичности. R-метод обусловливает сегментацию хромосом, противоположную той, которая имеет место при окраске G-методом.

С-метод дифференциальной окраски позволяет анализировать лишь некоторые районы хромосом — участки так называемого конститутивного гетерохроматина, локализованного в околоцетромерных областях длинных плеч хромосом 1, 9 и 16, в длинном плече Y-хромосомы, а также в коротких плечах акроцентрических хромосом.

Для дифференциальной окраски хромосом могут использоваться флуорохромы: акрихин, акрихин-иприт, квинакрин и другие (Q-метод окраски). По результатам дифференциальной флуоресцентной окраски идентифицируют каждую пару гомологов, а по свечению Y-хроматина определяют наличие Y-хромосомы в интерфазном ядре.

Третий этап исследования кариотипа человека заключается в световом микроскопировании фиксированных и окрашенных препаратов метафазных хромосом. Для адекватного выявления хромосомных аномалий необходимо проанализировать не менее 30 метафазных пластинок. В том случае, если предполагается мозаицизм по хромосомным аномалиям, количество анализируемых хромосом должно быть увеличено. Число клеток (n) необходимых для анализа с целью определения заданного уровня мозаицизма можно определить по формуле биноминального распределения: Р = (1 — р) n , где р — заданный уровень мозаицизма, Р — вероятность обнаружения мозаицизма. Учитывая, что в различных клетках организма количество нормальных и аномальных клонов может различаться, для выявления мозаицизма может потребоваться анализ нескольких тканей, например, клеток крови, фибробластов, половых желез.

В настоящее время наиболее широко применяется исследование общего анализа крови, позволяющее оценить качественный и количественный состав крови. Гематологическая норма является статистическим показателем и отражает среднюю величину, наблюдаемую в популяции здоровых лиц.

Показатели кровиПолСреднее значениеПределы нормальных колебанийЭритроциты, ×10 12 /лМ4,64,0 — 5,1Ж4,23,7 — 4,7Гемоглобин, г/лМ148132 — 164Ж130115 — 145Цветовой показатель0,930,82 — 1,05Ретикулоциты, %0,70,5 — 1,5СОЭ, мм/чМ5,01,0 — 10,0Ж9,02,0 — 15,0Гематокрит, %М4642 — 50Ж4036 — 45Тромбоциты, ×10 9 /л250180 — 320Лейкоциты, ×10 9 /л6,44,0 — 8,8Нейтрофилы палочкоядерные, %3,51 — 6Нейтрофилы сегментоядерные, %58,045,0 — 70,0Эозинофилы, %3,00 — 5Базофилы, %0,50 — 1Лимфоциты, %28,518,0 — 40,0Моноциты, %6,02 — 9

Забор крови для проведения анализа производят из пальца или из вены. Анализ сдается утром, натощак. В течение 8 часов до сдачи анализа не допускается прием пищи, в том числе, соки, чай, кофе, алкоголь. Можно пить простую воду.

Подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов можно производить с использованием микроскопа и камеры Горяева-Розенталя и современных геманализаторов. В то же время, исследование мазка крови способно помочь в диагностике патологических процессов, при которых количественное содержание клеток может оставаться нормальным.

Эритроциты составляют основную массу форменных элементов крови. У человека они лишены ядра и имеют двояковогнутую форму.

Снижение количества эритроцитов наиболее часто встречается в клинической практике и является одним из признаков анемического синдрома. Но следует помнить, что относительное уменьшение количества эритроцитов может наблюдаться при увеличении объема плазмы (гидремии), за счет усиленного притока тканевой жидкости в период схождения сердечных и почечных отеков, при введении большого количества жидкости внутривенно.

Повышение количества эритроцитов наблюдается при эритремии (болезнь Вакеза), а также при вторичных абсолютных и относительных эритроцитозах.

Абсолютные эритроцитозы встречаются при:

хронических обструктивных заболеваниях легких,
врожденных или приобретенных пороках сердца,
первичной легочной гипертензии,
синдроме Пиквика,
пребывании в высокогорных районах,
стенозе почечных артерий,
поликистозе почек,
гидронефрозе,
злокачественных новообразованиях (например, надпочечников),
болезни и синдроме Кушинга,
лечении стероидами.

Относительные эритроцитозы встречаются при неукротимой рвоте, диарее, массивных ожогах и шоке.

При исследовании патологических изменений морфологии эритроцитов можно выявить:

клетки различной формы (пойкилоцитоз),
клетки различной окраски (анизохромия),
клетки различного размера (анизоцитоз),
различные внутриклеточные включения.

Размеры нормальных эритроцитов (нормоцитов) составляют 7,2 — 8,0 мкм в диаметре. Анизоцитоз — патологическое состояние, при котором происходит изменение размеров эритроцитов:

микроцитоз (менее 7,0 мкм в диаметре) наблюдается при железодефицитных анемиях, гемоглобинопатиях;
макроцитоз (более 8,0 мкм в диаметре) — при анемии беременных, дефиците витамина В₁₂ и фолиевой кислоты, а также при заболеваниях печени, алкоголизме и злокачественных новообразованиях;
мегалоцитоз (более 11 мкм в диаметре) — при дефиците витамина В₁₂ и фолиевой кислоты, анемиях беременных, глистных инвазиях.

В крови здорового человека содержание нормоцитов не превышает 70 % от всего объёма, тогда как на долю микроцитов и макроцитов приходится до 15 %. Изменение этого соотношения, которое может быть определено анализом крови, указывает на развитие анизоцитоза. Клинические симптомы анизоцитоза сходны с анемией или сердечной недостаточностью и характеризуются быстрой утомляемостью, упадком сил, учащённым сердцебиением и одышкой. Лечение анизоцитоза, как правило, сводится к устранению причины его появления.

Анизоцитоз и пойкилоцитоз встречаются практически при всех видах анемий. При этом форма эритроцитов может быть:

шаровидной (болезнь Минковского — Шоффара),
серповидной (наследственная серповидноклеточная гемолитическая анемия),
овальной (при наследственном овалоцитозе),
мишеневидной (при талассемии и свинцовом отравлении).

Окраска эритроцитов также может меняться:

гипохромия (уменьшение интенсивности окраски эритроцитов) характерна для многочисленных железодефицитных анемий, талассемии, свинцового отравления;
гиперхромия (повышение насыщения эритроцитов гемоглобином) встречается при дефиците витамина В₁₂ и фолиевой кислоты, алкоголизме, беременности.

Полихроматофилы (эритроциты с недостаточным накоплением гемоглобина и остатками базофильной субстанции) наблюдаются как в норме, так и при увеличении регенераторной активности костного мозга во время острой кровопотери, массивном гемолизе.

При проведении исследований с помощью автоматических анализаторов часто используются расчетные величины.

Цветовой показатель (ЦП) отражает среднее содержание гемоглобина в эритроците и определяется по формуле:

Нормы цветового показателя равны 0,82 — 1,05. По величине цветового показателя анемии делят на:

гипохромные (0,82 и ниже),
нормохромные (0,82 — 1,05),
гиперхромные (1,1 и выше).

Определение гематокрита (Ht) проводят микроцентрифугированием или автоматическим способом. Величина гематокрита дает представление о соотношении между объемами плазмы и форменных элементов (главным образом эритроцитов), полученными после центрифугирования крови. Выражается в процентах и рассчитывается по формуле:

Норма гематокрита у мужчин 40,7–50,3%, у женщин — 36,1–44,3%. Этот показатель меняется как в сторону повышения, так и понижения.

Повышение наблюдается при обезвоживании организма, уменьшении ОЦП (массивные ожоги, шок), первичных и вторичных эритроцитозах.
Снижение может быть при гипергидратации организма, увеличении ОЦП.

Средний эритроцитарный объем (СЭО) определяют с помощью геманализатора и вычисляют по формуле:

Единицей СЭО являются фемтолитры (фл). Этот показатель в среднем одинаков для мужчин и женщин — 80–94 фл.

Уменьшение СЭО встречается при микроцитарных анемиях.
Увеличение — при макроцитарных и мегалобластических анемиях.

Среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССГЭ) отражает абсолютное содержание гемоглобина в одном эритроците в пикограммах (пг) и вычисляется по формуле:

Среднее содержание гемоглобина в эритроците составляет 27 — 33 пг. Данный показатель снижается при гипохромных железодефицитных анемиях и анемиях при злокачественных опухолях, повышается при гиперхромных анемиях.

Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКГЭ) отражает степень насыщения эритроцита гемоглобином, выражается в г/дцл. Вычисляется по формуле:

Нормальное значение этого показателя составляет 34,4 г/дцл (30 — 38,5). СКГЭ может только понижаться как при гипохромных анемиях, так и гиперхромных.

Ретикулоциты — молодые формы эритроцитов, образовавшиеся из нормобластов после потери ими ядра. В норме их количество равно 0,5–1,5% в периферической крови. Ретикулоцитоз отражает эритропоэтическую активность костного мозга.

Увеличение числа ретикулоцитов наблюдается при усиленной регенерации костного мозга, например, при острой кровопотере, гемолитической анемии.
Уменьшение — при гипо- и апластических анемиях, В₁₂-дефицитной анемии, метастазах в костный мозг, указывая на снижение регенераторной функции костного мозга.

Еще более точным показателем эритропоэза является ретикулоцитарный индекс (РИ), который вычисляется с учетом гематокрита по формуле:

меньше 2 – свидетельствует о сниженной продукции эритроцитов,
более 2–3 – свидетельство увеличения образования эритроцитов.

Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) зависит от содержания белков в плазме крови, главным образом фибриногена и γ-глобулинов, состоящих в основном из иммуноглобулинов, и количества форменных элементов.

Основными причинами повышения СОЭ являются воспалительные бактериальные и асептические процессы, сопровождающиеся изменениями белкового спектра плазмы крови (системные заболевания соединительной ткани, хронические гепатиты и циррозы печени, инфаркт миокарда и др.).

При злокачественных новообразованиях увеличение СОЭ обусловлено той же причиной. Значительное повышение СОЭ выявляют при увеличении в плазме концентрации парапротеинов при миеломной болезни и макроглобулинемии Вальденстрема. При всех видах анемий происходит увеличение СОЭ.

Уменьшение СОЭ является признаком повышения вязкости крови при заболеваниях и синдромах, сопровождающихся увеличением числа эритроцитов.

Тромбоциты играют важную роль в поддержании баланса между свертывающей и противосвертывающей системами крови, являясь важным звеном тромбоцитарно-сосудистого механизма гемостаза. Нормальное количество тромбоцитов составляет 180—320×10 9 /л.

В клинической практике могут наблюдаться состояния, характеризующиеся как увеличением количества тромбоцитов (тромбоцитоз), так и уменьшением (тромбоцитопения), а также нарушением адгезивных, агрегационных и коагуляционных функций тромбоцитов (тромбоцитопатии).

первичные (идиопатический, эссенциальный и хронический мегакариоцитарный лейкоз),
вторичные (причинами которых являются железодефицитные анемии, спленэктомия, злокачественные новообразования, коллагенозы, хронические воспалительные заболевания кишечника, сублейкемический миелоз, эритремия и др.)

Тромбоцитопении также бывают:

первичными (острая или хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура),
вторичными, которые развиваются при воздействии:
- физических факторов — ионизирующего излучения и механического повреждения тромбоцитов;
- биологических факторов — иммунных антител, цитолитических факторов опухолевых клеток, переливания «старой» консервированной крови, вирусных заболеваний;
- химических факторов — промышленных и бытовых химических веществ, лекарственных препаратов.

Лейкоциты — клетки крови, образующиеся в костном мозге и лимфатических узлах, характеризуются высокой и сложной структурной организацией и специализацией. В норме количество лейкоцитов составляет 4,0—8,8×10 9 /л.

Различают 5 видов лейкоцитов: гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы) и агранулоциты (моноциты и лимфоциты). Основной функцией лейкоцитов является защита организма от чужих для него антигенов (в том числе, микроорганизмов, опухолевых клеток, клеток трансплантата).

Лейкоцитоз (увеличение количества лейкоцитов) может встречаться у здоровых людей после приема пищи, богатой белками; тяжелой физической работы и во время стресса; после перегревания или охлаждения. В патологии основными причинами лейкоцитоза являются:

острые инфекции,
любые острые или хронические воспалительные заболевания,
заболевания, сопровождающиеся распадом тканей (инфаркт миокарда, инсульт, панкреонекроз и др.) и/или выраженной интоксикацией (уремия, кетоацидоз),
патологические состояния, для которых характерна выраженная гипоксемия (острая кровопотеря),
действие токсических веществ (угарного газа, ртути) и физических факторов (ионизирующего излучения),
злокачественные новообразования,
острые и хронические лейкозы, сопровождающиеся пролиферацией одного из ростков кроветворения,
полицитемия,
заболевания, характеризующиеся иммунными нарушениями (коллагенозы, сывороточная болезнь и другие).

Лейкемоидная реакция — это стойкий лейкоцитоз до 30–50×10 9 /л и более, развивается при инфекции, злокачественных новообразованиях, экзогенной и эндогенной интоксикациях и других состояниях. В отличие от лейкозов при лейкемоидной реакции в крови циркулируют нормальные, преимущественно зрелые нейтрофилы.

У пожилых людей, истощенных и ослабленных больных при развитии ряда заболеваний, для которых характерен лейкоцитоз, он может отсутствовать из-за снижения иммунной сопротивляемости организма.

Лейкопения (уменьшение количества лейкоцитов) встречается при следующих патологических состояниях:

вирусных инфекциях,
некоторых бактериальных и протозойных инфекциях,
гипоплазии и аплазии костного мозга,
побочном действии цитостатических препаратов, антибиотиков, сульфаниламидов, НПВС,
спленомегалии.

Лейкоцитарная формула (лейкограмма) — это процентное соотношение различных видов лейкоцитов в периферической крови. При различных заболеваниях может происходить изменение лейкоцитарной формулы за счет:

увеличения или уменьшения какого-либо вида лейкоцитов;
появление различных дегенеративных изменений в ядре и цитоплазме зрелых клеток лейкоцитов;
появление в периферической крови молодых незрелых лейкоцитов.

В клинической практике лейкограмма имеет большое значение. По данным лейкограммы можно судить о ходе патологического процесса, появлении осложнений и прогнозировать исход болезни. Данные лейкограммы следует сопоставлять с клиническими проявлениями болезни.

Нейтрофилы — подвид гранулоцитарных лейкоцитов, обладающие, в основном, бактерицидной и дезинтоксикационной функциями. Ведущий механизм их иммунной функции — фагоцитоз. Они являются микрофагами, то есть способны поглощать лишь относительно небольшие чужеродные частицы или клетки.

В зависимости от степени зрелости и формы ядра в периферической крови выделяют палочкоядерные (более молодые, незрелые) и сегментоядерные (зрелые) нейтрофилы. Более молодые клетки нейтрофильного ряда – метамиелоциты, миелоциты, промиелоциты – появляются в периферической крови в случае патологии и являются свидетельством стимуляции образования клеток этого вида. Длительность циркуляции нейтрофилов в крови составляет в среднем примерно 6,5 часов, затем они мигрируют в ткани.

Сегментоядерные нейтрофилы в норме являются основным видом лейкоцитов, циркулирующих в крови человека, составляя 45–70% общего количества лейкоцитов крови. Палочкоядерные нейтрофилы в норме составляют 1—6 %.

Нейтрофилез — увеличение количества нейтрофилов больше 6,0×10 9 /л — является отражением своеобразной защиты организма на воздействие экзогенных и эндогенных факторов, обычно сочетается с лейкоцитозом и имеет те же причины.

При оценке диагностической и прогностической значимости нейтрофильного сдвига важно определить процентное соотношение незрелых и зрелых нейтрофилов.

Сдвиг формулы влево — это повышение в периферической крови палочкоядерных нейтрофилов (при гнойно-воспалительных процессах, острых инфекциях) и (реже) появление в небольшом количестве незрелых гранулоцитов.
Сдвиг формулы вправо — это увеличение в периферической крови зрелых сегментоядерных нейтрофилов и снижение или исчезновение палочкоядерных, как правило, свидетельствует о благоприятном течении заболевания.

Нейтропения — снижение содержания нейтрофилов ниже 1,5×10 9 /л — свидетельствует о функциональном или органическом угнетении костномозгового кроветворения или об интенсивном разрушении нейтрофилов. Обычно сочетается с лейкопенией.

Эозинофилы — подвид гранулоцитарных лейкоцитов. Они обладают фагоцитарными свойствами, но это свойство используют прежде всего для участия в аллергическом процессе. Они фагоцитируют комплекс антиген-антитело, образованные преимущественно Ig E. В норме содержание эозинофилов в крови: 0–5%.

Эозинофилия — увеличение количества эозинофилов в периферической крови более 5%. Чаще всего встречается при аллергических заболеваниях (бронхиальной астме, крапивнице, сывороточной и лекарственной болезнях), паразитарных инвазиях, заболеваниях соединительной ткани, кожи, неспецифическом язвенном колите, заболеваниях крови (лимфогрануломатозе, эритремии, хроническом миелолейкозе).

Эозинопения — уменьшение количества эозинофилов, встречается при инфекционных, гнойно-воспалительных процессах и приеме глюкокортикоидов. Наиболее выраженная эозинопения выявляется при эндокардите Леффлера, эозинофильном лейкозе и гиперэозинофильном синдроме, приеме глюкокортикоидов.

Базофилы — очень крупные гранулоциты: они крупнее нейтрофилов и эозинофилов. Гранулы базофилов содержат большое количество гистамина, серотонина, лейкотриенов, простагландинов и других медиаторов аллергии и воспаления. Базофилы участвуют в воспалительных и аллергических процессах в организме. В норме содержание базофилов в крови: 0–1%.

Базофилия (увеличение числа базофилов) встречается редко, например, при миелопролиферативных процессах (хроническом миелолейкозе, полицитемии, миелофиброзе), гипотиреозе, лимфогрануломатозе. Базопения (уменьшение количества базофилов) диагностического значения не имеет.

Лимфоциты — главные клетки иммунной системы, представляющие собой разновидность лейкоцитов группы агранулоцитов. Лимфоциты обеспечивают гуморальный иммунитет (выработка антител), клеточный иммунитет (контактное взаимодействие с клетками-мишенями), а также регулируют деятельность клеток других типов. В норме содержание лимфоцитов в крови: 18–40%.

Лимфоцитоз — увеличение числа лимфоцитов в периферической крови. Это увеличение может быть абсолютное (больше 3,5×10 9 /л) при острых инфекциях, туберкулезе, гипертиреозе, лимфолейкозе и лимфосаркоме. Но чаще встречается относительный лимфоцитоз (увеличение процента лимфоцитов при нормальном или пониженном абсолютном их количестве). Такое состояние встречается при вирусных инфекциях, гнойно-воспалительных процессах, протекающих при пониженной сопротивляемости организма, брюшном тифе, агранулоцитозе.

Лимфоцитопения — уменьшение числа лимфоцитов в периферической крови. Абсолютная лимфоцитопения (количество клеток менее 1,2×10 9 /л) может указывать на недостаточность Т-системы иммунитета (иммунодефицит), а также характерна для милиарного туберкулеза, лимфомы, острой и хронической лучевой болезни, миеломной болезни. Относительная лимфоцитопения самостоятельного значения не имеет.

Моноциты — крупные зрелые одноядерные лейкоциты группы агранулоцитов. Ведущий механизм их иммунной функции — фагоцитоз. Они являются макрофагами, то есть могут поглощать относительно крупные чужеродные частицы и клетки (или большое количество мелких частиц), и, как правило, не погибают после фагоцитирования (но возможна гибель моноцитов при наличии у фагоцитированного материала каких-либо цитотоксических для моноцита свойств). Этим они отличаются от микрофагов — нейтрофилов и эозинофилов, способных поглощать лишь относительно небольшие чужеродные частицы, и, как правило, погибающих после фагоцитирования.

Длительность циркуляции моноцитов в крови составляет в среднем примерно 2-3 дня, затем большинство из них — либо гибнет через апоптоз, либо становятся макрофагами (например, в кишечнике). В норме содержание моноцитов в крови: 2–9%.

Моноцитоз — увеличение числа моноцитов в периферической крови. Встречается в виде абсолютного моноцитоза при некоторых инфекциях (инфекционном мононуклеозе, подостром септическом эндокардите, вирусных, грибковых, риккетсиозных и протозойных инфекциях), длительно протекающих гнойно-воспалительных заболеваниях, злокачественных солитарных опухолях, заболеваниях крови: остром моноцитарном лейкозе, хроническом миелолейкозе, миеломной болезни, лимфогрануломатозе, апластической анемии.

Моноцитопения (снижение или отсутствие моноцитов в периферической крови) развивается при тяжелых инфекционных процессах (сепсис).

источник