Билирубин химический состав его

Билирубин и его фракции

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции

Принцип

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

Клинико‑диагностическое значение

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

источник

Билирубин: современные теоретические представления

Билирубин (лат. bilis желчь + ruber красный) — один из желчных пигментов жёлто-красного цвета.

Химический состав молекулы билирубина — C₃₃H₃₆O₆N₄. Молекулярная масса — 584,68. В чистом виде билирубин представляет собой кристаллическое вещество, состоящее из кристаллов ромбоидально-призматической формы жёлто-оранжевого или красно-коричневого цвета, трудно растворимое в воде.

В основе молекулы билирубина, как и всех его производных — четыре пиррольных кольца, унаследованные от гемоглобина. Две гидроксильные группы обусловливают кислотные химические свойства билирубина и его способность образовывать соли. Расположение гидроксильных групп имеет варианты, основной из которых — их присоединение ко 2 и 3 пиррольным кольцам (билирубин IXα).

Химические формы билирубина и их названия

Традиционно выделяют две основные химические формы билирубина:

1. Свободный, или неконъюгированный билирубин, химическая формула которого приведена выше. Свободный билирубин может существовать в виде многочисленных структурных разновидностей, среди них т. н. фотопродукты.
2. Связанный, или конъюгированный билирубин, представляющий собой соединение свободного билирубина с глюкуроновой кислотой:

свободный билирубин + глюкуроновая кислота = связанный билирубин

При этом билирубин может быть связан с одной молекулой глюкуроновой кислоты (моноглюкуронид билирубина) или с двумя (биглюкуронид билирубина).

Билирубин также разделяют на непрямой и прямой. С давних пор сложилась практика, что непрямой билирубин отождествляют со свободным, а прямой — со связанным. Но это не совсем верно.

О различии прямого билирубина и связанного

Дело в том, что термины «непрямой» и «прямой» билирубин являются не химическими, а технологическими и отражают результат широко используемой для лабораторной идентификации билирубина реакции Ван ден Берга. Поскольку считалось, что непрямой билирубин представлен свободным, а прямой — исключительно связанным, то эти термины использовались как взаимозаменяемые.

Эта простая схема утратила корректность после того, как обнаружили ещё одну химическую форму билирубина: билипротеин, или дельта-билирубин.

Дельта-билирубин принимает участие в реакции Ван ден Берга аналогично связанному билирубину и учитывается в результате совместно с ним в качестве прямого. Поэтому формула «прямой билирубин = связанный билирубин» верна только в отношении здоровых людей, у которых дельта-билирубин практически отсутствует. При некоторых же болезненных состояниях прямой билирубин может на 60-90% состоять из дельта-билирубина:

прямой билирубин = связанный билирубин + дельта-билирубин

О свойствах и диагностическом значении дельта-билирубина читайте ниже.

Источники образования билирубина

Практически единственным источником происхождения билирубина в организме является гем.

Гем представляет собой структуру, включающую, подобно билирубину, четыре пиррольных кольца, а кроме того, атом железа. Гем входит в состав молекул гемоглобина (кислород-переносящего белка красных кровяных телец), сократительного мышечного белка миоглобина и клеточных ферментов цитохромов.

Основной, эритроцитарный поток билирубина (85% от всего количества) формируется в процессе утилизации гемоглобина отживших свой век (около 120 дней) эритроцитов крови. Такие эритроциты извлекаются из кровяного потока и разрушаются главным образом в селезенке, а также в печени и в костном мозге. Повышение билирубина эритроцитарного происхождения бывает при гемолизе (так называют массовый распад эритроцитов).

Остальные источники дают начало т. н. шунтовому билирубину, который составляет до 15% от всего его количества. Среди источников шунтового билирубина выделяют:

• Дефектные эритроциты и их незрелые предшественники. Такие клетки в результате постоянной отбраковки погибают вскоре после своего рождения, не успев покинуть «инкубатор» клеток крови — костный мозг. Число таких клеток, и соответственно, количество шунтового билирубина резко возрастает при некоторых наследственных, аутоиммунных, опухолевых заболеваниях системы крови. В нормальных же условиях костный мозг дает не более 7% билирубина.
• Небольшое количество билирубина образуется в процессе постоянного обновления и деструкции мышечного белка миоглобина. Тем не менее, травмы, сопровождающиеся обширным разрушением мышечной ткани могут привести к кратковременному повышению уровня билирубина в крови.
• Незначительная часть билирубина также поступает со всех тканей организма в результате распада цитохромов и некоторых белков, не содержащих гем, в частности, пероксидаз.

Как показали денситометрические исследования с применением меченого радиоактивным изотопом глицина, гем, дающий начало шунтовому билирубину, существует не более 10 дней. В то же время длительность существования гема нормальных эритроцитов совпадает с продолжительностью жизни самих эритроцитов — 120 дней. Зная долю шунтового билирубина в его общей концентрации, можно судить о характере болезненного процесса, однако пока такой анализ доступен только в научных исследованиях.

Трансформацией гема в билирубин, помимо многих других задач, заняты тканевые макрофаги, являющиеся частью иммунной системы организма. Тканевые макрофаги имеются во всех органах, располагаясь обычно в их соединительной ткани, но преимущественно они сосредоточены в селезенке, в лимфатических узлах, в печени и в костном мозге. Все тканевые макрофаги ведут свою родословную от моноцитов, выращенных в кроветворной матрице костного мозга, но в различных органах они специализированы для выполнения особых задач, а потому имеют и особые названия — например, купферовы клетки печени, гистиоциты селезенки и др. Ранее систему тканевых макрофагов называли ретикулоэндотелиальной системой, но сейчас этот термин признан устаревшим.

• 80% билирубина производят купферовы клетки печени
• оставшуюся часть — макрофаги костного мозга и селезенки
• совсем небольшое количество — гистиоциты соединительной ткани всех органов

Каждые сутки в организме человека подвергаются деструкции 2*10 8 состарившихся эритроцитов. При этом высвобождается 6-8 г гемоглобина, из которого, в свою очередь, берет начало 250-350 мкг билирубина.

Высвободившийся гем поглощается макрофагами, после чего преобразуется с участием внутриклеточного фермента гемоксигеназы в промежуточное вещество биливердин. Одновременно от гема отщепляется атом железа и окись углерода. Биливердин, имея зеленый цвет, принадлежит к числу пигментных веществ. Кроме того, в отличие от билирубина, он хорошо растворим в воде.

На втором этапе расщепления гема при помощи фермента биливердинтрансферазы происходит трансформация биливердина в билирубин — пигментное вещество желто-оранжевого цвета, нерастворимое в воде. Как известно, в составе каждой молекулы гемоглобина входят четыре единицы гема. Соответственно, при расщеплении одной молекулы гемоглобина образуются четыре молекулы билирубина и четыре атома железа.

Как уже говорилось, в качестве побочного продукта при разрушении углеродных связей гема выделяется окись углерода (СО), причем это единственная реакция в организме, которая дает на выходе это вещество. Это обстоятельство используется в перспективном методе исследования: измеряя концентрацию окиси углерода в выдыхаемом воздухе, можно оценить скорость расщепления гема в организме.

Последовательным превращением гема в зеленый биливердин, а затем в желто-красный билирубин объясняется изменение цвета синяков после ушибов от темно-синего в сине-зеленый, а затем в желтый.

Свойства свободного билирубина

Итак, в нашем организме существует постоянно действующий конвейер производства свободного билирубина как часть физиологического механизма замены старых эритроцитов крови. Это порождает несколько трудно решаемых проблем:

• Свободный билирубин — токсичное вещество, а потому необходим надежный механизм его выведения из организма и поддержания его концентрации на безопасно низком уровне. Токсичность билирубина проявляется в первую очередь в отношении мозговой ткани. Даже умеренно повышенный уровень свободного билирубина проявляется невыраженными симптомами со стороны нервной системы: ослабление внимания, утомляемость и др. Впрочем, у взрослых концентрация свободного билирубина никогда не достигает настолько опасного уровня, чтобы повлечь повреждение нервной системы. А вот у новорожденных такое случается. В частности, иммунологический конфликт может привести к массивному гемолизу и развитию т. н. «ядерной» желтухи. При этом свободный билирубин, уровень которого в сыворотке крови может повыситься в десятки раз и достичь 300 мкмоль/л и выше, накапливается в мозговой ткани, вызывая необратимые изменения в подкорковых ядрах головного мозга.
• Свободный билирубин практически нерастворим в воде. Поскольку все биологические жидкости организма являются водными растворами, свободный билирубин невозможно вывести из организма в том виде, в каком он есть, не изменив его химической структуры.
• Вместе с тем свободный билирубин хорошо растворим в жирах. Благодаря этому свойству он легко преодолевает фосфолипидные мембраны т. н. гемато-энцефалического барьера, призванного ограждать мозговую ткань от проникновения в нее многочисленных токсических веществ, циркулирующих в кровяном русле.

В кровеносном русле свободный билирубин транспортируют белки-альбумины, удерживая его на своей поверхности. 1г альбумина переносит 8,5мг билирубина. Комплекс альбумин-билирубин непрочный и распадается при первой возможности.

Реакция Ван ден Берга идентифицирует свободный билирубин в качестве непрямого.

Билирубин как антиоксидант

В свете новейших исследований несколько изменилось традиционное представление о билирубине как об однозначно «шлаковом» продукте. Свободный билирубин обладает выраженными антиоксидантными свойствами, и организм активно их использует.

Антиоксидантная активность билирубина значительно превышает таковую у α-токоферола (витамина Е), который считают классическим антиоксидантом. Так, билирубин инактивирует H₂O₂ в концентрации, которая в 10 раз больше его собственной. В частности, он препятствует перекисному окислению липидов клеточных мембран, а также окислению мембранных белков. Наиболее значимы антиоксидантные свойства билирубина в отношении нервной ткани и сердечной мышцы, поскольку эти ткани не располагают достаточно мощной собственной защитой от свободных радикалов.

Обнаружилось, что люди с хронически высоким уровнем свободного билирубина значительно реже болеют атеросклерозом сосудов и связанными с ним заболеваниями сердца. Доказана обратнопропорциональная зависимость между уровнем свободного билирубина в крови и сердечной патологией.

Одно из исследований, охватившее 10000 пациентов, доказало более низкую смертность от опухолевых заболеваний среди людей с высоким уровнем свободного билирубина.

В свете этих данных выглядит целесообразной трансформация хорошо растворимого в воде биливердина в «неудобный» нерастворимый билирубин.

Преобразование свободного билирубина в связанный

Поскольку, как уже сказано выше, свободный билирубин нерастворим в воде, его выведение из организма невозможно без предварительной трансформации в другие, водорастворимые вещества.

Конкретным местом такой трансформации является основная структурная единица печени — печёночная клетка, или гепатоцит. Гепатоциты собраны в печёночные дольки. Печёночная долька устроена таким образом, что каждая печеночная клетка с одной стороны имеет контакт с венозным кровеносным капилляром (т. н. синусоидом), а с другой к ней подведен жёлчный капилляр.

Свободный билирубин, транспортируемый на поверхности альбумина, из венозной крови синусоида перемещается сначала в пространство Диссе, разделяющее капилляр и печеночную клетку, а затем через клеточную мембрану внутрь гепатоцита, одновременно освобождаясь от связи с альбумином. Такое перемещение происходит без затраты энергии благодаря перепаду концентрации.

Внутри клетки билирубин соединяется обратимой связью с белками-лигандинами. Лигандины препятствуют «бегству» билирубина обратно в венозный капилляр, а также препровождают его в сетчатую структуру — эндоплазматический ретикулум.

В эндоплазматическом ретикулуме имеются т. н. микросомы — пузырьки, наполненные ферментами. На поверхности микросом при каталитическом участии фермента глюкуронилтрансферазы происходит реакция соединения свободного билирубина с глюкуроновой кислотой, в результате чего появляется новое вещество — связанный, или конъюгированный билирубин.

Данная реакция может проходить в один или два цикла, давая на выходе соответственно моноглюкуронид или биглюкуронид билирубина. Соотношение моноглюкуронида и биглюкуронида составляет 4:1.

Глюуронизация билирубина является одним из самых «узких мест» в его метаболизме, поскольку она лимитирована количеством фермента глюкуронилтрансферазы. Это количество резко снижено (менее 1-3% от нормы) при некоторых наследственных заболеваниях, в частности при синдроме Жильбера.

Затрудненное выделение связанного билирубина в желчь ведет к его накоплению в крови. В таких случаях почки вынуждены взять на себя функцию его выведения из организма, хотя в нормальных условиях они этого не делают. Появление в моче билирубина служит признаком серьезного заболевания.

Свойства связанного билирубина

Связанный билирубин своими свойствами выгодно отличается от свободного:

• он нетоксичен
• хорошо растворим в водных средах
• легко выводится из организма, преимущественно с желчью, а при необходимости и с мочой.

Связанный билирубин принимает участие в прямой реакции Ван ден Берга, поэтому его обычно называют прямым билирубином.

Следует отметить и нехорошее свойство связанного билирубина: при его избыточной концентрации в жёлчи он склонен к кристаллизации и к образованию билирубиновых камней в жёлчном пузыре. Поскольку высокая концентрация связанного билирубина является следствием повышенного образования в организме свободного билирубина, то причинами таких состояний обычно бывают гемолитические анемии и другие забалевания системы крови.

О решающей роли печени в метаболизме билирубина

Таким образом, единственным органом в человеческом организме, способным осуществить преобразование свободного билирубина в связанный, является печень.

Решающая роль печени в метаболизме билирубина ещё более очевидна, если принять во внимание, что 80% свободного билирубина также производится в печени купферовыми клетками. Уровень билирубина является одним из самых надёжных индикаторов функционального состояния печени, поскольку почти весь процесс обмена билирубина находится в теснейшей зависимости от этой функции.

Забота об утилизация билирубина не случайно возложена на печень, которую по праву называют главной химической лабораторией организма. Печень преобразует в нетоксические химические формы огромное количество веществ, как естественно образующихся в организме, так и попадающих в него извне, в том числе и лекарственных веществ.

Некоторые конечные продукты метаболизма преимущественно выводятся из организма через почки с мочой, другие — через печень с жёлчью. Какой из двух путей предпочтителен для каждого конкретного вещества — это обусловлено особенностями его химического строения и физиологии печени и почек. Общий принцип таков: почки хорошо выводят вещества с молекулярной массой менее 300 у. е., остальные выводятся главным образом с жёлчью, в их числе и билирубин.

Следует сказать, что для переработки билирубина печёночная клетка использует универсальные ферментные системы, которые наряду с билирубином принимают участие в метаболизме многих других веществ. Наряду с экономией ресурсов организма такая ситуация иногда приводит и к отрицательным последствиям. Дело в том, что ряд веществ, в частности многие лекарственные препараты конкурируют с билирубином в ферментативных реакциях и при передозировке способны полностью вытестить последний из метаболического процесса. Это приводит к накоплению непрямого билирубина в организме и к развитию т. н. «неконъюгированной» желтухи. К числу таких препаратов принадлежит парацетамол и некоторые другие нестероидные аналгетики, некоторые антибиотики.

Связанный билирубин выделяется из гепатоцита в желчный капилляр и выводится с желчью в кишечник. Выделение связанного билирубина в желчный капилляр требует затраты энергии, поэтому повреждение печеночных клеток при гепатитах, циррозах и др. приводит к расстройству этого процесса.

Трансформация билирубина в кишечнике и её продукты

Таким образом, связанный билирубин выделяется с потоком желчи в кишечник. Именно билирубин придает желчи грязно-зеленый оттенок.

Поскольку обитающие в кишечнике микроорганизмы активно работают над его содержимым, билирубин также повергается дальнейшей трансформации. В процессе переработки билирубина в кишечнике образуются многочисленные промежуточные вещества. Процесс переработки билирубина в кишечнике является многоэтапным и происходит с образованием многочисленных промежуточных веществ.

Основные этапы кишечной трансформации:

• Под воздействием бактериального фермента β-глюкуронидазы конъюгированный билирубин подвергается гидрозизу (расщеплению) с образованием свободного билирубина
• Свободный билирубин в результате серии реакций восстановления трансформируется в целый ряд веществ под общим названием «уробилиногены», или «уробилиноиды». В основе уробилиногенов, как и билирубина, находится структура из четырех пиррольных колец. Уробилиногены бесцветные.

В числе уробилиногенов важнейшими являются такие вещества:

• мезобилиноген — родоначальник группы уробилиногенов
• стеркобилиноген
• собственно уробилиноген

Большая часть уробилиногенов в итоге трансформируется в конечные пигментные продукты — стеркобилин и уробилин, которые имеют оранжево-коричневый цвет. Именно эти вещества придают фекалиям характерный цвет. Обесцвечивание фекалий свидетельствует об отсутствии в них билирубина, что бывает при гепатитах или при перекрытии желчевыводящих путей. 10-20% уробилиногенов всасываются из кишечника и через систему воротной вены возвращаются в печень. Печень же делает с ними то, что умеет: переводит в связанный билирубин и отправляет обратно в кишечник. В норме не более 2-5% уробилиногенов выводятся с мочой. Такое небольшое количество не выявляется при обычном лабораторном исследовании мочи.

При гепатитах печень не справляется с утилизацией уробилиногенов, вследствие чего они обнаруживаются в моче. Уробилиногены в моче — важный диагностический признак заболеваний печени.

Реакция Ван ден Берга и другие методы определения билирубина

Настало время объяснить происхождение несколько странных названий: «прямой» и «непрямой» билирубин. А названы так две формы билирубина с легкой руки господина Ван ден Берга (Van Den Berg), разработавшего еще в 1916 году реакцию идентификации билирубина в сыворотке крови при помощи реактива Эрлиха. По прошествии 100 лет реакция, названная в его честь реакцией Ван ден Берга, остается в лабораторной практике основным методом исследования содержания билирубина.

Не углубляясь в детали методики, которая за сотню лет подверглась многочисленным модификациям, отметим её принципиальную особенность — двухэтапность выполнения:

• Первый этап (прямая реакция Ван ден Берга): в пробирку с исследуемой сывороткой крови добавляют реактив Эрлиха Вскоре при наличии в сыворотке связанного билирубина содержимое пробирки приобретает ярко-розовый цвет. Свободный билирубин, блокированный альбумином, не принимает участия в реакции. При помощи колориметрического прибора по интенсивности окраски можно определить количественное содержание связанного билирубина. Таким образом, связанный билирубин, принимающий участие в прямой реакции, назван «прямым» билирубином.
• Второй этап (непрямая реакция Ван ден Берга): в другую пробирку с исследуемой сывороткой сначала добавляют вещество, осаждающее альбумины. В оригинальном исполнении Ван ден Берга с этой целью использовался 96˚ этиловый спирт. В дальнейшем этиловый спирт был заменен на более эффективные вещества. Альбумин при этом оседает на дно пробирки, а разблокированный свободный билирубин приобретает способность вступать в химическую реакцию с реактивом Эрлиха, что он и делает. Одновременно с непрямым билирубином в реакции участвует и прямой билирубин (если он есть), то есть непрямая реакция Ван ден Берга определяет общий билирубин как сумму прямого и непрямого билирубина. Содержание непрямого билирубина вычисляют как разницу общего и прямого билирубина:

непрямой билирубин = общий билирубин — прямой билирубин

Реакция Ван ден Берга, наряду с несомненными достоинствами, в числе которых простота выполнения и наглядность результата, имеет и существенный недостаток — она даёт завышенное содержание прямого билирубина. Так, в сыворотке здоровых людей этот метод обнаруживает до 5,4 мкмоль/л прямого билирубина, который составляет до 25% от общего. В действительности, как показывают более точные методы, у этих людей общий билирубин почти на 100% представлен непрямым, а прямой практически отсутствует. Впрочем, в клинической практике важнее знать не содержание билирубина само по себе, а его динамику, для чего необходимо обеспечить сопоставимость результатов, полученных в разное время и в разных лабораториях.

Фракции билирубина, определенные методом высокоэффективной жидкостной хроматографии:

• α — свободный билирубин
• β — моноглюкуронид билирубина
• λ — биглюкуронид билирубина
• δ — дельта-билирубин, или билипротеин

Разработаны и другие методы обнаружения билирубина, подробное описание которых выходит за рамки этой статьи:

• спектрофотометрия
• газоанализатор
• высокоэффективная жидкостная хроматография
• неинвазивный метод — рефлективная денситометрия

Среди названных методов наиболее перспективна высокоэффективная жидкостная хроматография. Данная методика позволяет определить содержание четырёх фракций билирубина:

• α — свободный билирубин
• β — моноглюкуронид билирубина
• λ — биглюкуронид билирубина
• δ — дельта-билирубин, или билипротеин

Дельта-билирубин

Дельта-билирубин представляет собой соединение конъюгированного билирубина (биглюкуронида или моноглюкуронида билирубина) с альбумином. В научной литературе часто используют и другое название этого вещества: «билипротеин». Это вещество желтого цвета.

Реакция Ван ден Берга не позволяет отдельно определить дельта-билирубин и идентифицирует его совместно с глюкуронидами билирубина в качестве прямого, поскольку все эти вещества вступают в прямую реакцию с реактивом Эрлиха аналогичным образом. Для селективного определения его содержания в сыворотке крови используют высокоэффективную жидкостную хроматографию.

В биохимическом и физиологическом аспектах дельта-билирубин обладает рядом особенностей, которые в целом позволяют рассматривать его наряду со свободным и связанным билирубином как самостоятельную, третью форму билирубина:

• В отличие от комплекса альбумина со свободным билирубином, дельта-билирубин является достаточно устойчивым веществом, поскольку его компоненты необратимо связаны прочной ковалентной химической связью.
• Синтез молекулы дельта-билирубина не требует участия внутриклеточных элементов, поэтому возможен in vivo и in vitro, т. е. как в организме, так и в пробирке.
• Дельта-билирубин нетоксичен для тканей организма.
• Из-за чрезмерной массивности своей молекулы дельта-билирубин в неизменённом виде совершенно не выводится из организма ни с желчью, ни через почки.
• Установлено, что период полураспада дельта-билирубина в организме такой же, как и у обычного альбумина, и составляет 14-21 день. Только после разрушения альбумина появляется возможность вывести из организма ранее соединённый с ним глюкуронид билирубина, преимущественно с жёлчью.

В нормальных условиях дельта-билирубин не обнаруживается в значимых количествах. Его содержание резко повышается при холестазе, т. е. нарушении выработки и выделения компонентов желчи на фоне сохранённой функции синтеза конъюгированного билирубина. Холестаз может быть как внутрипеченочным при гепатитах и циррозах печени, так и внепеченочным, обусловленным затруднением для оттока жёлчи во внепеченочных жёлчных путях, что обычно бывает при их закупорке жёлчным камнем.

Содержание дельта-билирубина при холестазе может достигать 60-70 и даже 90% от прямого. Благодаря своей «живучести» в организме дельта-билирубин (а вместе с тем и прямой билирубин в целом) остаётся высоким ещё в течение 1-1,5 недель после нормализации оттока жёлчи. Этим объясняется непонятный ранее феномен, когда прямой билирубин длительное время остаётся высоким, вопреки явному клиническому улучшению и нормализации других лабораторных показателей, в частности трансаминаз.

В то же время не происходит повышения содержания дельта-билирубина при неконъюгированных гипербилирубинемиях (накопление в крови неконъюгированного билирубина, что бывает при гемолитических анемиях, синдроме Жильбера и некоторых других состояниях).

Люмирубин и другие фотопродукты билирубина

В свое время химики заинтересовались парадоксальной растворимостью свободного билирубина. Теоретически молекула билирубина благодаря наличию двух гидроксильных групп COOH — должна обладать выраженной полярностью. Как известно, вещества с поляризованной молекулой растворимы в воде и нерастворимы в жирах. В действительности свободный билирубин ведет себя противоположным образом.

Загадку удалось разгадать при помощи рентренокристаллографии. Выяснилось, что молекула свободного билирубина имеет такую пространственную конфигурацию, в которой поляризующие гидроксильные группы блокированы внутренними межводородными связями (т. н. Z-Z связи). Такая конфигурация молекулы билирубина наиболее устойчива и является основной, поскольку располагает минимумом пространства и энергии. Также было обнаружено, что наряду с основной конфигурацией существуют и многочисленные другие варианты.

Наибольшего интереса среди них заслуживают фотопродукты билирубина, которые образуются под воздействием синего света в присутствии атомарного кислорода. Молекулы билирубина, поглощая энергию фотонов света, меняют внутренние межатомные Z-Z связи на более высокоэнергетические Z-E и E-E связи. При этом вместе с изменением пространственной конфигурации молекул радикально изменяются и их свойства — они становятся водорастворимыми.

Фотопродукты благодаря хорошей водорастворимости быстро выводятся из организма печенью. Самой высокой скоростью выведения обладает один из фотопродуктов с E-E связями, названный люмирубином. Фотопродукты отличаются малой продолжительностью жизни, поскольку такие молекулы при первой возможности избавляются от излишней энергии и возвращаются к исходной, основной конфигурации.

Способность свободного билирубина образовывать водорастворимые фотопродукты используют для лечения желтухи новорожденных методом фототерапии.

источник