Билирубин каким методом определяют

Методы определения билирубина и его метаболитов

Определение билирубина в сыворотке крови

В клинической практике используются различные методы определения билирубина и его фракций в сыворотке крови.

Наиболее распространенным из них является биохимический метод Ендрассика-Грофа. Он основан на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. При этом связанный конъюгированный билирубин (билирубин-глюкуронид) дает быструю («прямую») реакцию с диазореактивом,тогда как реакция непрямого свободного (не связанного с глюкуронидом) билирубина протекает значтельно медленнее. Для ее ускорения применяют различные вещества–акселераторы, например кофеин (метод Ендрассика-Клеггорна-Грофа), которые освобождают билирубин из белковых комплексов («непрямая» реакция). В результате взаимодействия с диазотированной сульфаниловой кислотой билирубин образует окрашенные соединения. Измерения проводят на фотометре.

Нормальная концентрация в крови:

общий билирубин — 8,5-20,5 мкМ/л,
связанный (прямой) билирубин — 0,9-4,3 мкМ/л,
свободный (непрямой) билирубин — 6,4-17,1 мкМ/л,
в моче у здоровых людей не определяется,

Уробилиноген в моче — 0,08-4,23 мкМ/сутки,
Стеркобилиноген в кале — 50-300 мл/сутки.

Рефферентные значения нормальных показателей общего, непрямого и прямого билирубина для взрослых, и детей приведены в таблице:

Таблица 2. Дифференциально-диагностические критерии желтух

Минеральный обмен

• Общие понятия. Функции минеральных веществ

• Промежуточный и конечный обмен минеральных веществ

• Характеристика отдельных элементов

• Обмен воды и электролитов

Минеральный обмен – совокупность процессов всасывания, распределения, усвоения и выделения минеральных веществ, находящихся в организме преимущественно в виде неорганических соединений.

Всего в организме обнаруживается свыше 70 элементов таблицы Д.И. Менделеева, 47 из них присутствуют постоянно и называются биогенными. Минеральные вещества играют важную роль в поддержании кислотно-основного равновесия, осмотического давления, системе свертывания крови, регуляции многочисленных ферментных систем и пр., т.е. имеют решающее значение в создании и поддержании гомеостаза.

По количественному содержанию в организме они делятся на макроэлементы, если их больше чем 0,01 % от массы тела (К, Са, Мg, Na, P, Cl) и микроэлементы (Mn, Zn, Cr, Cu, Fe, Co, Al, Se). Основную часть минеральных веществ организма составляют хлористые, фосфорнокислые и углекислые соли натрия, кальция, калия, магния. Соли в жидкостях организма находятся в частично или полностью диссоциированном виде, поэтому минеральные вещества присутствуют в виде ионов – катионов и анионов.

В результате биохимического исследования крови можно установить содержание магния (0,8-1,2ммоль/л), железа (9,0-31,3 мкмоль/л), натрия (135-145 ммоль/л), калия (3,5-5,0 ммоль/л), кальция (2,23-2,57 ммоль/л), фосфора (0,8-1,45 ммоль/л), хлора (95-105 ммоль/л).

Функции минеральных веществ:

1) пластическая (кальций, фосфор, магний);

2) поддержание осмотического давления (калий, натрий, хлор);

3) поддержание буферности биологических жидкостей (фосфор, калий, натрий);

4) поддержание коллоидных свойств тканей (все элементы);

5) детоксикационная (железо в составе цитохрома Р-450, сера в составе глутатиона);

6) проведение нервного импульса (натрий, калий);

7) участие в ферментативном катализе в качестве кофактора или ингибитора;

8) участие в гормональной регуляции (йод, цинк и кобальт входят в состав гормонов).

источник

Билирубин и его фракции

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции

Принцип

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

Клинико‑диагностическое значение

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

источник

Определение общего билирубина в сыворотке крови

(метод Иендрашика и Клеггорна)

Принцип метода. Билирубин образуется в организме в результате естественного распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень,селезенка). Билирубин относится к группе желчных пигментов и является токсическим веществом; он обезвреживается в клетках печени. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком. В печени происходит процесс обезвреживания по схеме:

билирубин + УДФ-глюкуроновая кислота билирубин (моно- и диглюкуроид)

Глюкурониды билирубина хорошо растворимы, они выводятся из печени по желчевыводящим путям.

В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый (диглюкуронид ). Вместе обе формы составляют общий билирубин.

Определение содержания билирубина в крови является важным диагностическим тестом. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах-0,5-1,2 мг/дл, причем 75% из них составляет билирубин, связанный с белками (нерастворимый).

При различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия, концентрация билирубина повышается до 30-35 мг/дл.

Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окраски продукта взаимодействия билирубина с диазореактивом. Этот продукт окрашен в малиново-красный цвет. Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно.

Связанный с белками билирубин реагирует с диазосмесью после диссоциации белкового комплекса, которая достигается прибавлением к сыворотке кофеинового реактива.

Ход определения. Готовят две пробирки (контрольную и опытную). Составляют реакционную смесь по схеме:

Диазосмесь готовят (в количестве, достаточном для всей учебной группы), смешивая 10 мл 0,5%-ного раствора сульфаниловой кислоты и 0,3 мл 0,5%-ного раствора нитрата натрия.

Содержимое опытной и контрольной проб хорошо перешивают, ставят на 20 минут в темноту, затем колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 500-560 нм) против контроля.

Если в пробах развивается слабая окраска, то перед колориметрированием в обе пробирки добавляют по 3 капли 30%-ного раствора NaOH. При этом цвет раствора переходит в зеленый, а при большей концентрации билирубина в синий, часто наблюдается исчезновение мути. Пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром. Расчет производят по калибровочному графику.

Калибровочный график для определения концентрации общего билирубина.

Оформление работы. В протокол вносят принцип метода, результаты колориметрии и расчет. Отмечают пределы колебаний концентрации билирубина в норме.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Определение билирубина в крови

Как определяется билирубин в крови и его нормы

Билирубин – сложный компонент, является одним из главных составляющих желчи в организме. Образуется под воздействием расщепления эритроцитов. Выделяется печенью. Покидает организм в составе желчи. Выводится из организма с испражнениями через кишечник.

Повышение или понижение билирубина может свидетельствовать о ряде заболеваний органов брюшной полости у взрослых. В данной статье мы рассмотрим влияние билирубина на организм новорожденных детей.

Повышение данного компонента происходит вследствие незрелости печеночных ферментов у младенцев. Главный признак высокого билирубина – пожелтение склер и кожи новорожденного. Такое явление называется «желтухой». Согласно статистике, 60% новорожденных рождаются с желтухой.

Билирубин содержится в крови в двух фракциях: свободной и связанной.

Билирубин Свободный (непрямой) – образуется при распаде гемоглобина и расщепления эритроцитов. Является ядовитым, поскольку не успевает пройти фильтрацию печенью. Не растворим в воде. Попадает с кровью в печень, где становится растворимым. Негативно влияет на клетки за счет своей токсичности.

Билирубин Связанный (прямой) – производная непрямого билирубина. Обладает меньшей токсичностью, поскольку проходит фильтрацию печенью. Экскретируется жёлчными протоками. Далее попадает в тонкую кишку и выводится из организма.

Очень высокое содержание билирубина опасно таким явлением как гипербилирубинемия. У новорожденных оно может вызывать тяжелые нарушения функций мозга, потерю слуха, повреждение центральной нервной системы, даже летальный исход. Все это происходит за счет сильного токсического действия непрямого билирубина в крови.

Показания к проведению исследования на определение билирубина в крови

— Оценка функционирования печени.
— Диагностика и определение вида желтух.
— Диагностика анемий.
Лабораторные исследования включают в себя определение общего и прямого билирубина. Величина непрямого рассчитывается как разница между прямым и общим.

Как берется анализ у новорожденных

Обычно кровь берется из пятки. Место укола протирается спиртом, затем стерильным скальпелем или шприцом производится забор крови в пробирку.

Существуют современные скрининг-тесты, позволяющие определить билирубин через кожу. Такой метод хорош своей безболезненностью, но, к сожалению, он не слишком распространен.

В современных лабораториях в основном используют диазреактивы для определения реакции. Для этого сыворотка крови смешивается с реактивом. Результат определяется по скорости реакции.

— Прямая быстрая реакция окрашивает сыворотку в розовый цвет. Это свидетельствует о механической желтухе.
— Прямая замедленная реакция окрашивает сыворотку в течение нескольких минут. Это свидетельствует о паренхиматозной желтухе.
— Непрямая реакция окрашивает сыворотку в фиолетовый цвет. Это свидетельствует о развитии различных анемий или гемолитической желтухе.
Таким образом, можно говорить о достаточно точном диагностировании желтух по уровню билирубина.

Нормальный уровень билирубина для новорожденных – понятие относительное, поскольку его концентрация может падать каждые 3 часа. На результат анализа могут повлиять такие факторы как:

— срок рождения ребенка (доношенный или нет);
— его возраст в часах;
— нормы измерения конкретной лаборатории.

Примерные значения нормального уровня билирубина

Таблица норм для новорожденных в возрасте до 7 дней:

Возраст Недоношенные Доношенные

Меньше 24 часов 170 ммоль/л

Старше 72 часов > 340 ммоль/л

Данные показатели актуальны для новорожденных, находящихся еще в роддоме. Поскольку физиологическая желтуха – явление довольно частое, детям первого месяца жизни иногда не назначается данный вид анализов при отсутствии жалоб в его поведении. Повышенные показатели в таком возрасте часто происходят за счет фракции непрямого билирубина. Происходит усиленное разрушение эритроцитов. Если процесс желтухи затянулся, пожелтение кожных покровов не проходит или усугубилось со временем, анализ на определение билирубина обязателен.

Для примера возьмем новорожденного, возрастом более двух недель.

Концентрация общего билирубина

До 85 ммоль/л Легкая форма желтухи

86-169 ммоль/л Форма средней тяжести

Свыше 170 ммоль/л Тяжелая форма

Данное исследование актуально для новорожденных, поскольку помогает выявить вид желтухи и необходимость ее лечения. Если физиологическая желтуха проходит сама по себе, то перенесенная ядерная желтуха может привести к умственным и неврологическим отклонениям в развитии ребенка. Важно не пропустить этот момент, и вылечить повышенный билирубин вовремя.

Если понравилась статья помогите проекту, поделитесь в соцсетях.

источник