ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ
Получение и подготовка крови к исследованию.
Кровь рекомендуется брать лучше утром в одни и те же часы (до кормления и водопоя), после отдыха и успокоения животного.
Стабилизация крови.
Для предупреждения свертывания крови используют один из следующих антикоагулянтов (на 10 мл крови): щавелевокислый натрий (калий или аммоний) — 0,01-0,02 г: (оксалатная кровь); лимоннокислый натрий — 0,02 г (цитратная кровь); фтористый натрий — 0,01 г; гепарин — 1 капля раствора, содержащего в I мл 5000 ME гепарина (гепаринизированная кровь). Антикоагулянты вносят в пробирку, в которую затем собирают кровь; пробирку закрывают резиновой пробкой и тщательно смешивают содержимое 1-2 минуты.
Получение сыворотки крови. Собранную в пробирку или стеклянный цилиндр кровь ставят сначала в теплое место (на 15- 20 минут), а потом в холодное. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок сосуда стеклянной палочкой или тонкой проволочкой. Полученную сыворотку осторожно отсасывают. Для лучшего отделения сыворотки от сгустка пробирку со свернувшейся кровью можно процентрифугировать 10-15 минут при 2-3 тыс. оборотов.
Получение плазмы.
Стабилизированную кровь наливают в пробирку и центрифугируют 10 минут при 1,5-2,0 тыс. оборотов в минуту. В результате оседания форменных элементов крови в пробирке образуется прозрачная жидкость — плазма, которую отсасывают и переносят в другую пробирку.
Исследование физических свойств крови.
Из физических свойств крови важное диагностическое значение имеет определение ее удельного веса, вязкости и скорости свертывания, а также реакции оседания эритроцитов.
Определение удельного веса крови.
Удельный вес крови опредетяют по методу Гаммершлага (в смеси бензола с хлороформом) или по способу Филиппса (в растворах медного купороса).
В норме удельный вес крови колеблется в следующих пределах: v крупного рогатого скота — 1,040-1,059; овцы — 1,037-1,049, козы — 1,041-1,061; яка — 1,045-1,063, лошади — 1,038- 1 062; свиньи — 1,042-1,060, кошки — 1,053-1,057, собаки — 1 044-1,056, кролика — 1,048-1,060, курицы — 1,039-1,057; гуся — 1,045-1,063.
Повышение удельного веса крови отмечается при поносах, рвоте, лихорадке, экссудативных и транссудативных процессах и гипергидрозах, диабете, нефритах, отравлении угарным газом. Понижение удельного веса наблюдается при истощении и различных анемиях.
Определение вязкости крови.
Вязкость крови определяют вискозиметром Гесса или Детермана. У здоровых животных вязкость крови составляет: у крупного рогатого скота — 4,6-5,2, овцы — 4,4-6,0, козы — 5,0-6,0, верблюда — 4,3-5,3, лошади — 3,4- 7,2, свиньи — 4,0-5,0, собаки — 3,8-5,5, кошки — 4,0-5,0, кролика — 3,5-4,5, курицы — 4,5-5,5.
Повышенная вязкость крови наблюдается при некоторых лихорадочных заболеваниях (плеврите, воспалении легких, перитоните), при сердечной недостаточности в период декомпенсации. Понижение вязкости встречается при первичных и вторичных анемиях, истощении.
Определение скорости свертывания крови.
На край хорошо обезжиренного предметного стекла, поставленного под углом 50°, наносят каплю крови. Стекая по стеклу, капля оставляет след. Через каждые 30 секунд по следу крови проводят острием иглы. Появление нитей фибрина на острие иглы указывает на начало свертывания крови. В норме скорость свертывания крови равна у крупного рогатого скота 5-6, лошади — 8-10, собак — 10 минутам.
Ускорение свертывания крови отмечается при миоглобинурии, крупозном воспалении легких, постгеморрагических анемиях. Замедление свертывания крови встречается при анемиях, нефритах, холемиях, сибирской язве, гемофилии, удушье.
Определение реакции оседания эритроцитов.
Реакцию оседания эритроцитов (РОЭ) нужно определять не позже двух часов после взятия крови. Реакцию оседания эритроцитов определяют или методом Неводова, или методом Панченкова.
Метод Неводова.
РОЭ определяют при помощи эритроседиометра, представляющего собой пробирку длиной 17 см и шириной 9 мм, с делениями от 0 до 100. Объем градуированной части пробирки равен 10 мл. В эритроседиометр вносят 0,02 г щавелевокислого натрия и наполняют кровью до отметки 100, закрывают резиновой пробкой и тщательно смешивают кровь с антикоагулянтом. Пробирку ставят в штатив и отмечают на часах начало исследования. Уровень столба эритроцитов определяют через 15, 30, 45 и 60 минут, а затем через 24 часа.
Метод Неводова обычно используется для определения РОЭ у лошадей. В норме у лошади РОЭ по этому методу через 15 минут составляет 40 (34-46), через 30 минут — 55 (49-61), через 45 минут — 58 (55-61), через 60 минут — 59 (56-62), через 24 часа — 65 (59-71), а у крупного рогатого скота — 2-4 деления за 24 часа.
Метод Панченкова.
РОЭ определяют в аппарате, состоящем из штатива и нескольких градуированных капилляров. Каждый капилляр градуирован от 0 до 100 делений, на уровне «0» (верхняя часть капилляра) нанесена метка «К» (кровь), а на уровне цифры «50» — метка «Р» (реактив). Объем градуированной части капилляра равен 100 мм3. Для постановки реакции капилляр смачивают 5%-ным раствором лимоннокислого натрия, а затем насасывают этот же раствор до метки «Р» и выдувают на часовое стекло. После этого тем же капилляром 2 раза набирают кровь до метки «К», каждый раз выдувая кровь на часовое стекло. Раствор и кровь на часовом стекле тщательно смешивают стеклянной палочкой, образовавшуюся смесь набирают в капилляр до метки «0». Капилляр устанавливают в штатив, учет высоты столба осевших эритроцитов ведут через 1 час и 24 часа.
В норме скорость оседания эритроцитов за один час по методу Панченкова колеблется в следующих пределах (в мм): у крупного рогатого скота — 0,5-1,5; овцы 0,5-1,0, козы — 0,3-1,0, верблюда — 1,0-4,0, лошади — 40,0-70,0, свиньи — 2,0-9,0, собаки — 2,0-6,0, лисицы серебристо-черной — 1,0-14,0, голубого песца — 1,0-5,0, норки — 1,0-3,0, соболя — 2,0-4,0, куницы- 2,0-4,0, кролика — 1,0-2,0, курицы — 2,0-3,0.
У молодых животных РОЭ более ускорена, чем у взрослых. Ускорение РОЭ наблюдается при многих лихорадочных инфекционных заболеваниях (инфекционная анемия, кровопятнистая болезнь, мыт, ангина и др.), лучевой болезни и т. д. Замедление РОЭ отмечается при механических илеусах и энцефаломиелите, желтухах, гастроэнтеритах, паралитической миоглобинурии лошадей и др.
Исследование химических свойств крови.
При исследовании химических свойств крови определяют: количество гемоглобина, билирубина, показатель резервной щелочности, количество в сыворотке крови общего белка, каротина, кальция и неорганического фосфора.
Определение количества гемоглобина (по Сали).
Количество гемоглобина определяют в гемометре ГС-2, состоящехм из колодки с тремя гнездами, градуированной пробирки, капиллярной и глазной пипеток. В двух крайних гнездах находятся или стандартные пробирочки, содержащие раствор солянокислого гематина, или стеклянные палочки соответствующего цвета. В среднее гнездо вставляют градуированную пробирку, имеющую две шкалы. Одна шкала (от 2 до 23) показывает количество гемоглобина в граммпроцентах (г%), а другая (от 10 до 140) — в процентах (в единицах гемометра); 10006 соответствует 16,67 г% гемоглобина.
В градуированную пробирку до метки «10» вносят глазной пипеткой 0,1 н. раствор соляной кислоты. Капиллярной пипеткой насасывают 20 мм 3 крови и осторожно выдувают ее в раствор кислоты. Затем этот раствор втягивают и выдувают обратно в пробирку несколько раз, чтобы смыть оставшуюся в пипетке кровь. Перемешивают и оставляют на 5 минут. В результате смешивания крови с соляной кислотой гемоглобин переходит в солянокислый гематин, раствор при этом приобретает коричневый цвет. Затем по каплям добавляют дистиллированную воду, постоянно помешивая до тех пор, пока цвет жидкости в пробирке не сравняется с цветом боковых стандартных пробирок. По делению шкалы, которое соответствует уровню раствора в пробирке, устанавливают количество гемоглобина.
Гиперхромемия — увеличение количества гемоглобина в крови — отмечается при поносах, рвоте, потливости, при образовании экссудатов и транссудатов.
Определение билирубина в сыворотке крови (по Ван-ден-Бергу).
В центрифужную пробирку берут 1 мл сыворотки крови к 2 мл спирта, смешивают и центрифугируют 20 минут. Затем к 1 лед прозрачного центрифугата прибавляют 0,5 мл спирта и 0,25 мл свежеприготовленной смеси диазореактивов Эрлиха (см. ниже). Окрасившуюся жидкость переносят в стаканчик колориметра и колориметрируют, сравнивая ее со стандартом, находящимся во втором стаканчике. Расчет производят по формуле:
где: С1 — количество билирубина (в мг%), С2 — концентрация стандартного раствора, Н1 — высота столба исследуемой жидкости (в мм), Н2 — высота столба стандарта (в мм), 5 — степень разведения сыворотки.
Смесь диазореактивов Эрлиха готовят из двух растворов:
1) сульфаниловая кислота — 0,2 г, соляная кислота (удельный, вес 1,19) З мл, дистиллированная вода — 200 мл;
2) азотнокислый натрий — 0,5 г, дистиллированная вода — 100 мл.
Оба раствора хранят в темной посуде. Для анализа приготовляют смесь двух растворов, для чего берут 10,0 мл первого раствора и 0,3 мл второго.
В качестве стандарта применяют раствор сернокислого кобальта (2,161 г предварительно высушенного реактива доводят дистиллированной водой до 100 мл), который хранят в темноте.
Для определения разновидностей билирубина и, следовательно, для дифференциации желтух применяют прямую и непрямую реакции.
Прямая реакция.
На 1 мл сыворотки крови наслаивают 0,5 мл смеси диазореактивов. Появление на границе жидкостей бордово-красного кольца указывает на наличие билирубина, проведенного через печень.
Положительная реакция всегда свидетельствует о патологии. Если кольцо появляется быстро, то это указывает на механическую желтуху, замедленная реакция отмечается при катаральной желтухе, циррозе печени, болезнях сердца.
Непрямая реакция.
К 1 мл сыворотки крови прибавляют 2 мл спирта, смешивают и центрифугируют. Затем 1 мл прозрачного центрифугата наслаивают в другой пробирке на смесь диазореактивов (1,5 мл). На границе жидкостей появляется цветное кольцо от розового до красно-фиолетового цвета. Положительная реакция зависит от наличия в сыворотке крови билирубина, не проведенного через печень. В норме эта разновидность билирубина обнаруживается у лошади. Повышенное содержание такого билирубина наблюдается при гемолитической желтухе.
В норме в сыворотке крови содержится билирубина у лошадей от 0,37 до 1,35 мг%, крупного рогатого скота — 0,01-0,30 мг%;
У других животных содержание билирубина в сыворотке очень незначительное (следы).
Определение резервной щелочности (по Неводову).
К 10 мл 0 01 н. раствора соляной кислоты прибавляют 0,2 мл крови, смешивают и титруют из микробюретки 0,1 н. раствором едкого натра до появления мути и выпадения хлопьев. Расчет производят по формуле:
где: х — резервная щелочность (в мг%),
а — количество миллилитров 0,1 н. раствора едкого натра, израсходованного на титрование.
Периодически для контроля к 10 мл 0,01 н. раствора соляной кислоты добавляют 1-2 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н. раствором едкого натра, до появления розовой окраски (нейтрализация). На титрование должен быть израсходован 1 мл раствора щелочи.
У животных в норме показатели щелочного резерва крови по Неводову составляют (в мг%): у крупного рогатого скота — 460-540, овцы — 460-520, козы — 380-520, верблюда 700-780, яка — 520-620, лошади — 470-620, лисицы серебристо-черной 340-500.
Ацидоз — снижение щелочного резерва — возникает в результате нарушения обмена веществ при белковом перекармливании, скармливании силоса, содержащего масляную кислоту, при атониях преджелудков, родильном парезе, ацетонемии, диабете, ящуре и других заболеваниях.
Алкалоз, или базеоз — повышение щелочного резерва — встречается редко и наблюдается главным образом при пироплазмозе и кровопятнистой болезни лошадей, селикозе, фибринозном воспалении легких, шоке.
Определение общего белка в сыворотке крови.
Общий белок определяют рефрактометрически, а белковые фракции — методом электрофореза на бумаге. Количество общего белка и соотношение белковых фракций в сыворотке крови здоровых животных приведены в табл. 37.
Определение каротина в сыворотке крови (по Ф. А. Рачевскому).
В пробирку вносят 0,2 мл свежей сыворотки крови, приливают
4 мл спирта (96°) и тщательно смешивают. Добавляют 2 мл петролеиного эфира или чистого бензина с температурой кипения ниже /о . Содержимое пробирки хорошо перемешивают и оставляют на несколько минут. Затем приливают по каплям 2 мл дистиллированной воды, в результате чего между спиртом и эфиром образуется поверхность раздела. Каротин находится в петролейном эфире бензине) и окрашивает верхний слой жидкости в желто-зеленоватыи цвет. Петролеиныи эфир с каротином насасывают в микропику и наливают его по каплям в фарфоровую чашечку, подогрело до 40 . После нанесения каждой капли ожидают полного высыхания её.
Для проверки результатов рекомендуется параллельно ставить такую же пробу со стандартным раствором каротина.
Содержание каротина в сыворотке крови вычисляют но формуле:
где: х — количество каротина (в мг%),
К — количество миллилитров эфирного (или бензинового) экстракта каротина, израсходованного на образование j желтого кольца.
В норме у крупного рогатого скота содержится в сыворотке крови от 0,5 до 3,0 мг% каротина, у кур — 0,3-0,5 мг%.
Определение кальция в сыворотке крови (по де-Ваарда).
В центрифужную пробирку (лучше с остроконечным дном) берут 1 мл сыворотки крови, прибавляют 0,5 мл насыщенного раствора щавелевокислого аммония, тщательно смешивают, оставляют на 30 минут, после чего жидкость центрифугируют 15 минут при 1,5-2 тыс. оборотов в минуту. Затем отсасывают жидкость над осадком пастеровской пипеткой с грушей (или сливают). К осадку добавляют 2 мл 2%-ного раствора аммиака, смешивают встряхиванием и центрифугируют 10 минут; промывание осадка повторяют еще два раза. В заключение отсасывают жидкость над осадком, к осадку добавляют 0,3 мл 50%-ного раствора серной кислоты, смешивают. Ставят пробирку в водяную баню при температуре 50-70° и выдерживают до растворения осадка, изредка помешивая жидкость стеклянной палочкой.
После растворения осадка жидкость титруют 0,01 н. раствором перманганата калия до появления бледно-розового окрашивавия, сохраняющегося не менее 1-2 минут.
Одновременно ставят «слепой» опыт. В пробирку берут вместо 1 мл сыворотки крови 1 мл дистиллированной воды, а все остальное производят таким же образом, как и в основном опыте.
Подсчет количества кальция производят по формуле:
х = 0,2-(а — б)*К*100,
Где: х — искомое количество кальция в сыворотке крови (в мг%)
а — количество миллилитров 0,01 н. раствора перманганата калия, израсходованного на титрование в основном опыте,
б — количество миллилитров 0,01 н. раствора перманганата калия, израсходованного на титрование в «слепом» опыте.
К — фактор к титру 0,01 н. раствора перманганата калия. В норме у животных количество кальция в сыворотке составляет (в мг %): у крупного рогатого скота — 9,5-12,5, овцы — 11-12,5, козы — 11,0-13,0, верблюда — 9,1-13,3, лошади — 12,0-16,0, свиньи — 11,5-12,5, собаки — 9,5-12,0, курицы — 170-22,0.
Гипокальцемия — уменьшение количества кальция в сыворотке крови — встречается при рахите, остеомаляции, нефрозе, родильном парезе, бронхопневмонии, экссудативном плеврите, анемии, лейкемии, диабете, остро протекающих тяжелых заболеваниях, хроническом сепсисе, тетании, недостаточности паращитовидных желез, лейшманиозе, контагиозной плевропневмонии, кровопятнистой болезни и др.
Гиперкальцемия — увеличение содержания кальция в сыворотке крови — наблюдается при остеомаляции, деформирующих артритах, гипервитаминозе, гиперпаратиреоидизме, сердечной недостаточности и т. д.
Определение неорганического фосфора в сыворотке крови (по Аммону и ГинсСергу).
В пробирку вносят 1 мл сыворотки крови, добавляют 3 мл дистиллированной воды и 1 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, хорошо смешивают и, дав постоять 10 минут, фильтруют через бумажный фильтр или центрифугируют.
Затем берут две широкие пробирки и в одну из них (опыт) вносят 2,5 мл фильтрата сыворотки, 0,5 мл раствора молибдена, 1 мл 1 %-ного раствора аскорбиновой кислоты и до 6 мл дистиллированной воды. В другую пробирку (стандарт) вливают 1 мл рабочего стандартного раствора фосфора, 1 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 20°о-ного раствора трихлоруксусной кислоты, 0,5 мл раствора молибдена, 1 мл 1 %-ного раствора аскорбиновой кислоты и до 6 мл дистиллированной воды. Реактивы в обе пробирки следует вносить по возможности одновременно. Содержимое пробирок хометре размешивают и через 10 минут колориметрируют в колори.
Количество неорганического фосфора определяют по формуле:
Где; X искомое количество неорганического фосфора (в мг%),
H1 — высота столбика жидкости с фильтратом сыворотки крови (в мм),
H2 — высота столба жидкости со стандартным раствором фосфора (в мм).
Раствор молибдена готовят смешиванием двух растворов:
1) молибденовокислого аммония — 25 г, дистиллированной воды — 300 мл;
2) дистиллированной воды — 125 мл, концентрированной серной кислоты — 75 мл.
Рабочий стандартный раствор фосфора готовят из основного стандартного раствора фосфора. Для приготовления последнего (его готовят впрок) берут 4,388 г однозамещенного фосфорнокислого калия, предварительно высушенного в эксикаторе, и добавляют дистиллированной воды до 1 л. Хранят раствор в темной посуде с добавлением к нему 0,5 мл хлороформа.
Для приготовления рабочего стандартного раствора фосфора, что делают в день исследования, берут 1 мл основного раствора и добавляют к нему дистиллированной воды до 50 мл; в 1 мл рабочего раствора содержится 0,02 мг фосфора.
Для приготовления 1-ного раствора аскорбиновой кислоты необходимо взять 1 г аскорбиновой кислоты и добавить 0,1 н. раствора соляной кислоты до 100 мл. Раствор хранят в темной посуде, годен не более одного месяца.
В сыворотке крови животных в норме содержится неорганического фосфора (в мг%): у крупного рогатого скота 4,5-7,5, овцы — 7-8, козы — 6-8, верблюда — 5,1-6,7, лошади — 7-7,3,: свиньи — 5-6, собаки — 3-5,8, кошки — 6-8, кролика — 6-7.
Гипофосфатемия— уменьшение количества неорганического фосфора в сыворотке крови — наблюдается При рахите, остеомаляции, гиперпаратиреоидизме, сахарном диабете, недостатке витамина D.
Гиперфосфатемия — увеличение содержания неорганического фосфора — отмечается при гипервитаминозе D, заживлении переломов костей, нефрозах, гломерулонефритах, гипопаратирериДизме.
Подсчет форменных элементов крови у животных.
В клинической практике обычно определяют количество эритроцитов и лейкоцитов, а иногда и тромбоцитов.
Определение количества эритроцитов.
Подсчет количества эритроцитов производят в счетной камере с сеткой Горяева (камера Горяева). Кровь набирают в смеситель (меланжер) до метки «0,5», а затем до метки «101» насасывают жидкость-разбавитель, при этом кровь разбавляют в 200 раз. В качестве разбавителя применяют 0,9%-ный или 3%-ный раствор поваренной соли, жидкость Гайема (сулема — 0,5 г, хлористый натрий — 1 г, сернокислый натрий — 5 г, дистиллированная вода — 200 мл) или раствор йода (йод кристаллический — 0,3 г, йодистый калий — 0,4 г, лимоннокислый натрий — 2 г, дистиллированная вода — 100 мл).
Кровь с разбавителем тщательно перемешивают 2-3 минуты, удаляют 2-3 капли из капилляра меланжера, а следующую каплю наносят под заранее притертое покровное стекло на сетку камеры- Заряженную камеру закрепляют на предметном столике микроскопа и выжидают 2-3 минуты, чтобы эритроциты осели на дно. Для обнаружения сетки камеры пользуются объективом 8, а при подсчете эритроцитов применяют объектив 40. Подсчет начинают с левого большого квадрата (разделенного на 16 маленьких квадратиков), а затем подсчитывают эритроциты еще в 4 больших квадратах, расположенных по диагонали сеткикамеры.
Количество эритроцитов в 1 мм3 крови определяют по формуле:
где: х — искомое количество эритроцитов в 1 мм 3 крови,
а — сумма эритроцитов, подсчитанных в 5 больших квадратах,
б — степень разведения крови,
в — количество маленьких квадратиков в 5 больших квадратах,
4000 объем разбавленной крови над одним маленьким
квадратиком сетки камеры (в мм 3 ). При разведении крови (1 : 200) и подсчете эритроцитов в 5 больших квадратах формула значительно упрощается и будет выглядеть так:
х = а * 10 000.
Эритропения, или олигоцитемия, — уменьшение количества эритроцитов — характерна для первичных и вторичных анемий. Сопоставление числа эритроцитов с количеством гемоглобина позволяет делать важные дифференциально-диагностические заключения.
Эритроцитоз, или нолицитемия — увеличение числа эритроцитов — встречается при сгущении крови вследствие потери организмом воды при обильном потоотделении, поносах, во время образования экссудатов и транссудатов, в начальной стадии инфекционных и лихорадочных процессов, при непроходимости тонкого отдела кишечника.
Здоровых животных приведено в табл. 38.
Лейкоцитоз, или гиперлейкоцитоз — повышение количества лейкоцитов — встречается очень часто. Лейкоцитоз может быть:
1) физиологическим — при беременности, у новорожденных, после сильной физической нагрузки и т. д.; 2) медикаментозным — после введения белковых препаратов, алкалоидов, жаропонижающих средств и т. д., 3) патологическим — при инфекционных болезнях, воспалительных процессах, интоксикациях и др.
Лейкопения — понижение числа лейкоцитов — наблюдается при тяжелых инфекционных и токсических состояниях и свидетельствует об угнетении кроветворных органов или об их истощении.
Подсчет количества тромбоцитов (по Реес-Эккеру). В смеситель для лейкоцитов набирают до метки «0,5» консервирующую тромбоциты жидкость (лимоннокислый натрий — 3,8 г, 40%-ный формальдегид — 0,2 мл, бриллианткрезиловая синь — 0,1 г, дистиллированная вода — до 100 мл). Затем в смеситель до метки «1» набирают капиллярную кровь из уха и до метки «И» раствор Тюрка (для гемолиза эритроцитов) и хорошо размешивают (2- 10 минут). После этого заряжают счетную камеру, которую на 15-20 минут ставят в чашку Петри с комочком мокрой ваты на дне для ускорения оседания тромбоцитов.
Тромбоциты подсчитывают в 20 больших квадратах сетки (т. е. в 320 маленьких квадратиках). Определяют количество тромбоцитов в 1 мм 3 крови по формуле:
где: х — искомое количество тромбоцитов в 1 мм3 крови, а — количество подсчитанных клеток, б — степень разведения крови (в 20 раз), в — количество сосчитанных маленьких квадратиков (320),
1/4000 — объем разведенной крови в камере над одним маленьким квадратиком сетки (в мм 3 ). сокращенном виде формула выглядит так:
Тромбоцитоз — увеличение числа тромбоцитов — встречается при инфлюэнце лошадей, плеврите, миоглобинурии, саркоматозных поражениях и др.
Тромбоцитопения — уменьшение количества тромбоцитов — наблюдается при инфекционной анемии лошадей, кровопятнистой болезни, стахиботриотоксикозе.
Подсчет форменных элементов крови у птиц.
Техника подсчета кровяных клеток у птиц несколько затруднена. Это объясняется тем, что у них как эритроциты, так и тромбоции — формы и имеют ядра, поэтому в обычных условиях не дифференцируются. Эти кровяные клетки не разрушаются уксусной кислотой, что препятствует определению числа лейкоцитов. В связи с этим при подсчете форменных элементов крови у птиц вначале в счетной камере подсчитывают общее количество клеток (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов), а затем в окрашенном мазке каждые 1000 эритроцитов устанавливают число лейкоцитов и тромбоцитов. В заключение перерасчетом определяют абсолютное количество отдельных видов клеток в 1 мм 3 крови.
Определить количество клеток в крови у птиц можно также прямым способом в камере Горяева, для чего применяют раствор с красителями. По К. С. Фоминой и В. И. Шмельковой, берут 0,1%-ный раствор азура на изотоническом растворе поваренной соли (раствор можно использовать в течение месяца). Кровь разводят в большом меланжере в соотношении 1 : 100 теплым раствором азура (38-40°). Немедленно после заполнения меланжера проиводят тщательное размешивание Крови встряхиванием кровомесителя. Через 10-15 минут заряжают камеру. Эритроциты подсчитывают в 5 больших квадратах, лейкоциты и тромбоция определяют по всей сетке камеры (225 больших квадратов)Я Вычисление количества кровяных клеток производят по обычным формулам.
Определение лейкоцитарной формулы.
Лейкоцитарную формулу определяют в окрашенных мазках крови.
Приготовление мазков крови. Мазки готовят на чистых обезжиренных предметных стеклах.
Хороший мазок доля;ен быть тонким, равномерным (несколько уже предметного стекла), длинным (не менее 2/3 стекла) и иметь свободные концы.
Фиксация мазков. Мазки высушивают па воздухе фиксируют в метиловом спирте 3-5 минут или используют другие фиксаторы: этиловый спирт — 20 минут, смесь эфира со спиртом поровну — 20 минут, ацетон — 5 минут.I
Окраска мазков. Мазки окрашивают красками, растворенными в нейтральной дистиллированной воде. Для определения реакции воды применяют следующий метод. 50 мл воды,в химический стаканчик, добавляют одну каплю 0,2%-ного раствора. При кислой реакции вода окрашивается в красно-фиолетовый, при нейтральной — в бледно-розовый, а прощелочной — в желтовато-соломенный цвет. Усредняют кислую воду 1%-ным раствором двууглекислой соды, а щелочную 1%-ным раствором уксусной кислоты.
Указанные растворы добавляют по каплям к окрашенной индикатором воде до появления темно-розового цвета. Затем вычисляют количество усредняющего створа на больший объем дистиллированной воды. Раскраску мазков производят по Романовскому-Гимза. Для этого помещают над чашкой на стеклянные палочки мазком вверх, наливают на них раствор краски Романовского — Гимза (на 1 мл нейтральной дистиллированной воды берут 1-2 капли краски) и красят 20-35 минут в зависимости от температуры окружающего воздуха. Можно также мазки положить в чашку Петри на спички (мазком вниз) и подлить под них краску. Затем мазок промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Правильно окрашенный мазок должен иметь розовато-фиолетовый оттенок.
Мазки можно окрашивать и без предварительной фиксации их. Для этого на высушенный мазок наносят 20 (30) капель спиртового раствора краски Романовского -Гимза (на 20 мл спирта берут 5 мл краски). Через 5 минут И краске добавляют 20 (30) капель дистиллированной воды и продолжают окрашивать еще 20-25 минут. Краску смывают водопроводной водой. Мазки сушат на воздухе.
Техника выведения лейкоцитарной формулы.
Лейкоцитарная формула выражает процентное соотношение отдельных форм лейкоцитов. В норме она слагается из соотношения базофилов, эозинофилов, нейтрофилов (юных, палочко ядерных и сегменто ядерных), лимфоцитов, моноцитов (табл. 39).
Для определения лейкоцитарной формулы в окрашенном мазке крови обычно подсчитывают 200 лейкоцитов. Количество клеток каждой формы лейкоцитов делят на 2, получая процентное выражение.
При подсчете лейкоцитов используют метод Шиллинга. Для этого на препарате выбирают 4 участка — два в начальной и два в конечной его части. В каждом участке отыскивают под иммерсионной системой микроскопа край мазка, подсчитывают здесь лейкоциты и передвигают препарат вглубь последовательно еще на 3 поля зрения. Затем смещают мазок на одно поле в сторону и возвращаются снова к краю препарата. Такие смещения мазка производят до тех пор, пока не будет подсчитано 50 лейкоцитов на одном участке. После этого находят таким же образом по 50 лейкоцитов на каждом другом участке мазка. Всего должно быть подсчитано 200 лейкоцитов.
Регистрацию отдельных форм лейкоцитов осуществляют или на специальном одиннадцати клавишном счетчике или в таблице Егорова.
Определение лейкоцитарного профиля.
Для более точного и полного суждения об изменениях в лейкоцитарном составе крови необходимо определить лейкоцитарный профиль, который выражает абсолютное содержание отдельных форм лейкоцитов в 1 мм3 крови. С этой целью подсчитывают общее количество лейкоцитов
в 1 мм 3 крови и выводят лейкоцитарную формулу. Затем количество лейкоцитов умножают последовательно на процент каждого вида клеток лейкоцитарной формулы и делят на 100.
В лейкоцитарной формуле при различных заболеваниях могут происходить следующие основные изменения:
1) увеличение или уменьшение процента тех или иных клеток — нейтрофилия или нейтропения (резкая нейтропения называется агранулоцитозом), лимфоцитоз или лимфопения, эозинофилия или эозинопения, моноцитоз или моноцитопения, базофилия;
2) появление молодых незрелых форм (юные, миелоциты и даже промиелоциты);
3) появление дегенеративных изменений в лейкоцитах — токсической зернистости и вакуолей в протоплазме, пикноза, лизиса, вакуолизации или полисегментации ядра, появление гигантских форм нейтрофилов.
Наиболее частым и практически самым важным является нейтрофильный лейкоцитоз. При этом лейкоцитозе наблюдается увеличение количества (повышение процента) незрелых нейтрофильных клеток в периферической крови, что именуется «сдвигом (ядра) влево», так как при записи лейкоцитарной формулы молодые клетки принято ставить слева от зрелых нейтрофилов.
По степени регенерации нейтрофильный лейкоцитоз разделяют на следующие три группы:
1) нейтрофилия с простым регенеративным сдвигом — количество палочкоядерных нейтрофилов возрастает не более чем на 13% при нормальном или несколько уменьшенном количестве сегментоядерных;
2) нейтрофилия с резким регенеративным (гиперрегенеративным) сдвигом — появляются юные, миелоциты и даже промиелоциты;
3) нейтрофилия с дегенеративным сдвигом — уменьшается количество сегментоядерных нейтрофилов, появляются атипичные клетки с дегенеративным ядром и протоплазмой, «сдвиг влево» углубляется за счет палочкоядерных, но без дальнейшего увеличения процента более молодых форм.
Определение качественных изменений клеток крови.
Исследование мазков крови, кроме определения лейкоцитарной формулы и лейкоцитарного профиля, позволяет также установить наличие тех или иных морфологических изменений эритроцитов и лейкоцитов, включая появление ядерных форм эритроцитов. В специально окрашенных мазках можно определить количество гранулоцитов (ретикулоцитов), т. е. эритроцитов с зернистой субстанцией. По количеству таких форм эритроцитов можно судить о степени регенерации крови.
источник