Глюкозооксидазный способ определения глюкозы
Для определения концентрации исключительно глюкозы в различных жидкостях организма человека используют глюкозооксидазный метод. Преимуществом этого теста является его точность. Диагностика в отличие от экспресс-методов позволяет выявить количество чистой глюкозы, без домеси к ней фруктозы и других сахаров. Принцип этой реакции заключается в окрашивании раствора, которое происходит вследствие взаимодействия окислителей со специфическими красителями. Оценка результатов исследования проводится с помощью метода колориметрии и сравнения со стандартными растворами.
Когда назначается проведение глюкозооксидазного метода?
Этот тест используют для выявления нарушения толерантности к сахару и развития преддиабета, а также в стадии разгара болезни. Но для таких целей анализ используют редко, это связано с его высокой стоимостью и длительным ожиданием результата. Чаще всего определение глюкозы в крови и моче с помощью этого метода применяют при дифференциальной диагностике таких заболеваний, как:
- синдром непереносимости лактозы;
- непереносимость фруктозы;
- выделение фруктозы с биологическими жидкостями организма;
- повышенная концентрация пентозы в моче.
Несомненным достоинством глюкозооксидазного теста является его точность.
Что в основе этого способа?
Существуют различные методы определения концентрации глюкозы в крови, но глюкозооксидазный является наиболее точным. Подоснова его состоит в том, что при взаимодействии сахара с кислородом воздуха происходит окисление реагента. В раствор выделяется перекись водорода. Это вещество взаимодействует с ортотолуидином, образуя окрашенное соединение. Для поведения этой реакции необходимо присутствие специальных ферментов. При реакции окисления должна присутствовать глюкозооксидаза, а при окрашивании жидкости — пероксидаза. Интенсивность окраски раствора будет зависеть от содержания глюкозы и быть более всего интенсивной при высоком ее содержании.
Суть глюкозооксидазного метода определения глюкозы
Оценка результата происходит с помощью количественного метода фотометрии через один и тот же промежуток времени. Обязательно использование калибровочного раствора, который содержит определенную заявленную норму сахара и, отталкиваясь от нее, можно судить о концентрации глюкозы в выделяемых жидкостях организма, чаще в крови.
Как проводится анализ?
Забор материала от больного осуществляется натощак. Для проведения теста используют венозную кровь в количестве 5 мл. Накануне диагностики больному показана строгая диета. Это позволит судить о достоверности результата и исключить возможные погрешности анализа. За 2 дня перед изъятием крови пациент должен отказаться от вредных привычек употребления алкоголя и курения. Также необходимо ограничить прием чрезмерно сладких блюд и по возможности избегать стрессовых ситуаций.
Чаще всего этот метод определения концентрации глюкозы выполняют способом центрифугирования, которым выделяют форменные элементы. Количество сахара определяют уже в плазме. При добавлении к ней всех необходимых реагентов окраска наблюдается через 20 минут, если тест проводится при комнатной температуре. Расчет уровня глюкозы проводится по калибровочному графику или с помощью правила порций.
Реактивы для исследования
Для определения сахара наиболее удобно использовать экспресс-методы определения глюкозы в крови. Это объясняется простотой в использовании и быстрым получением результата. Кроме этого, больному не нужно идти в лабораторию или больницу. Но в отличие от глюкозооксидазного теста такая диагностика является недостоверной. Так как не дифференцирует глюкозу от других сахаров и определяет их концентрацию вместе.
Основу глюкозооксидазной реакции составляет натрия хлорид 9% раствор и цинка сульфат 50%. Их добавляют на стадии центрифугирования крови. Кроме этого, используют буферный раствор с уксусной кислотой и ацетатом натрия. Методом титрования определяют его рН на уровне 4,8. После, добавляется глюкозооксидаза, из-за чего выделяется перекись водорода и пероксидаза, участвующая в окрашивании раствора до нужной концентрации для получения точного результата.
Нормы при проведении анализа
Измерение количества сахара происходит в специальных единицах — миллимолях на литр раствора.
Глюкозооксидазное исследование крови проходят обязательно на пустой желудок и используют для этого плазму или сыворотку. Норма количества ее для взрослых как для женщин, так и для мужчин составляет 3,3—5,5. Для детей до 15-ти лет этот показатель немного ниже и колеблется в пределах 3,2—5,3. У новорожденных глюкоза крови составляет 1,7—4,2. Увеличение показателей наблюдается при развитии у больного сахарного диабета или при нарушении толерантности к глюкозе. Это состояние является преддиабетом, и если его вовремя не лечить, то в скором времени оно приведет к развитию этой тяжелой патологии.
источник
Современные методы определения глюкозы
Герасименко В.А., к.м.н., Куриляк О.А., к.б.н.
Из архива газеты «Новости А/О Юнимед»
Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в КДЛ. Причина исключительной популярности теста связана с высокой заболеваемостью сахарным диабетом. Данный тест выполняется как в условиях стационара, так и в поликлиниках. Больные сахарным диабетом вынуждены исследовать уровень глюкозы в крови в домашних условиях, поскольку без этой информации им трудно скорректировать свою диету, физические нагрузки, применение инсулина и других сахароснижающих препаратов. Исключительная важность теста и большие объемы выполняемых исследований стимулировали разработчиков к созданию различных типов приборов и методов определения концентрации глюкозы в крови.
В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом.
Методы определения глюкозы в сыворотке крови
— фотометрический по конечной точке
— отражательная фотометрия – сухая химия
Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому мы на них не будем останавливаться.
Глюкозооксидазный метод
Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:
Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).
Среди вышеперечисленных способов регистрации наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О2 — , который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена.
На рис. 1 и 2 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.
Рисунок 1. Спектр рабочего раствора
Рисунок 2. Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза)
Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра (лучше специализированного биохимического фотометра типа Микролаб 540), так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.
Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра, например Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, полуавтоматических анализаторов, например Clima 15, или автоматических биохимических анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.
Рисунок 3. Измерительная ячейка
В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной (Рис. 3). На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.
Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н2О2. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.
В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод можно назвать автоматические анализаторы глюкозы Biosen (Германия). Эти приборы удобны для использования не только в стационарах, но и в поликлиниках, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.
Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление «сухой химии». Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Широко популярными во всем мире в настоящее являются глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».
Глюкометры One Touch предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.
Рисунок 4. Конструкция тест-полоски
В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови “притягивается” к поверхности тест-полоски при касании.Мембрана тест-полоск One Touch напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски.
В состав приборов One Touch входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: “ЖДАТЬ”. Когда капля крови наносится на тест-полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. После полного впитывания капли крови немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение величины отражения и автоматически запускает таймер. Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборы One Touch откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16 –ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.
С момента появления на рынке приборов One Touch прошло большое количество клинических исследований в лабораториях России, Америки и Европы. Одно из таких исследований было проведено Эндокринологическим научным центром РАМН по заказу Российской Ассоциации Медицинской Лабораторной Диагностики. Специалисты Центра провели сравнительный анализ двух методов измерения уровня глюкозы в крови. Результаты, полученные на One Touch, сопоставлялась с данными, полученными на биохимическом анализаторе Spectrum II (Abbott Laboratories, США), реализующем гексокиназный метод определения глюкозы. Было исследовано 190 проб крови от 95 пациентов. Коэффициент корреляции результатов составил 0,98641. Коэффициент вариации в нормальном и патологическом диапазонах на глюкометре One Touch не превысил 2,5%.
Рис. 5. Корреляционная зависимость показаний “One Touch” и «Спектрум-2» (коэффициент корреляции 0,98641)
В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.В официальном отчете Эндокринологического научного центра РАМН сказано: «приборы One Touch обладают высокой точностью и правильностью, а также широким диапазоном измерений. Их можно использовать для диагностики неотложных состояний при диабете, в том числе бригадами “Скорой помощи”, поскольку эти приборы не только надежны, но и быстро дают результаты».
Гексокиназный метод
Регистрация осуществляется при длине волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.
Из описанного разнообразия методов определения глюкозы сотрудники КДЛ могут решить для себя, какой способ определения и какой прибор выбрать:
- Методы «мокрой» биохимии, реализованные на автоматических биохимических анализаторах, обеспечат нужды лабораторий с большим потоком анализов.
- Анализаторы глюкозы типа Biosen требуют от оператора минимальных трудозатрат, так как они полностью автоматизированы и достаточно производительны (скорость от 50 до 200 проб в час).
- Для лабораторий с небольшим числом исследований, а также экспресс-лабораторий удобен специализированный биохимический фотометр Микролаб 540.
- Для бригад скрой помощи идеальное решение — глюкометры типа One Touch.
Т.о., задача КДЛ обеспечить не только быстрое, но и высокоточное определение глюкозы, на сегодняшний день вполне решаема.
источник
Количественное определение глюкозы в крови глюкозооксидазным методом
Принцип метода. Метод основан на специфичности действия фермента глюкозооксидазы. Этот фермент окисляет глюкозу в присутствии молекулярного кислорода с образованием глюконолактона, спонтанно гидролизирующегося до глюконовой кислоты. Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием пероксида водорода (Н2О2), который под действием пероксидазы реагирует с 4-аминоантипирином и фенолом. В результате образуется окрашенное в розовый цвет соединение, оптическая плотность которого при 510 нм пропорциональна концентрации глюкозы в образце.
глюкоза +О2 +Н2О 
→ глюконовая кислота + Н2О2
2 Н2О2 + 4-аминоантипирин + фенол 
→ хинонимин + 4Н2О
Оборудование: КФК, центрифуга, термостат, штативы, пробирки, пипетки, биологический материал, реактивы содержащиеся в рабочем растворе.
Калибровочный раствор глюкозы (эталон)
Пробирки инкубируют в термостате при 37 о С 15 минут, затем колориметрируют на КФК при зелёном светофильтре в кюветах с толщиной слоя 5 мм против холостой пробы (Н2О). Розовая окраска устойчива в течение 1 часа после инкубации.
Расчет содержания глюкозы производят по формуле:
С=
х С стандарт, где
С – содержание глюкозы в опытной пробе, моль/л;
Еоп – оптическая плотность пробы;
Ест – оптическая плотность калибровочной пробы;
С стандарт – содержание в калибровочном растворе, моль/л.
Нормальные величины: новорожденные – 2,8-4,4 ммоль/л
Гипогликемия (ГГК). Повышение уровня глюкозы в крови обусловлено множеством причин, в соответствии с которыми различают две группы гипергликемии.
1. Инсулярные – связанные с недостаточным содержанием в организме инсулина или обусловленные неэффективностью его действия.
2. Экстраинсулярные (внеинсулярные) – не зависят от влияния инсулина.
Наиболее существенное значение в формировании ГГК имеют следующие процессы: усиленный распад гликогена; повышенный неоглюкогенез; торможение синтеза гликогена; снижение утилизации глюкозы тканями под влиянием гормональных антагонистов инсулина: соматотропина, глюкортикоидов, тироксина, тиреотропина.
Алиментарные гипергликемии отмечают при избыточном поступлении глюкозы в кровь (например, гипергликемия при сахарной нагрузке). «Печеночные» гипергликемии встречаются при диффузных поражениях печени.
Стойкая и выраженная гипергликемия чаще всего сопровождает сахарный диабет. Принято выделять инсулинзависимый сахарный диабет и инсулиннезависимый сахарный диабет, или, соответственно, сахарный диабет I типа и сахарный диабет II типа. Формирование сахарного диабета I типа связано, прежде всего, с нарушениями синтеза и обмена инсулина.
Вторая группа гипергликемий связана, прежде всего, с гиперфункцией эндокринных желез, продуцирующих гормоны – антагонисты инсулина. Она наблюдается при таких заболеваниях, как синдром и болезнь Иценко-Кушинга, акромегалия, тиреотоксикоз, феохромоцитома, глюкоганома. Уровень глюкозы в крови повышается и при некоторых заболеваниях печени (в частности, у 10-30% больных циррозом печени), гемохроматозе (пигментном циррозе печени, бронзовом диабете).
Гипогликемия (ГПГ) — снижение содержания глюкозы в крови – чаще всего связана с абсолютным или относительным повышением уровня инсулина в крови. Внепанкреатическая гипогликемия отмечается в результате нарушения баланса между выраженностью процессов гликогенолиза и гликонеогенеза в печени при острых и хронических гепатитах, циррозах, острой и подострой дистрофии печени, алкогольной интоксикации, отравлениях мышьяком, фосфором, при длительной механической желтухе, застойной печени, первичном или метастатическом раке печени. Снижение концентрации глюкозы в крови часто наблюдается у больных, страдающих раком пищевода и другими злокачественными опухолями внепанкреатической локализации (фиброма, фибросаркома, нейрома), а также при неукротимой рвоте, анорексии, печеночном диабете, уремии, обильной лактации и глюкозурии у беременных.
Гипогликемия может быть центрального происхождения вследствие перенесенных психических травм, энцефалита, субарахноидального кровоизлияния, опухоли мозга.
1. Наследственные нарушения переваривания углеводов.
2. Какие виды гиперглюкоземии вам известны?
3. Каковы причины патологической гиперглюкоземии?
4. В чем причина возникновения инсулинзависимого сахарного диабета?
5. Каковы биохимические причины возникновения наследственных заболеваний: а)гликогенозов? б)агликогенозов? в)фруктоземии? г)галактоземии?
6. Каковы биохимические изменения углеводного обмена при голодании?
7. Принцип метода определения толерантности к глюкозе.
источник