Качественное количественное определение билирубина

Работа № 1. Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека

Принцип метода. В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в растворе. Разрушение билирубин-альбуминового комплекса (свободный, или непрямой билирубин) осуществляется кофеиновым реактивом, который одновременно переводит билирубин в растворимое диссоциированное состояние. Интенсивность образующейся окраски измеряется на ФЭКе при зеленом светофильтре (563 нм), а количество билирубина определяется по калибровочному графику.

Ход работы.В 3 пробирки отмерить указанные в таблице реактивы и колориметрировать через 5 — 10 мин. на ФЭКе в кювете 10 мм против контроля при зеленом светофильтре.

По калибровочному графику определить содержание общего и связанного билирубина. Вычитая из уровня общего билирубина количество прямого, рассчитать содержание непрямого (свободного) билирубина. Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.

Реактивы Пробирки
1-я 2-я 3-я
Сыворотка крови 1 мл 1 мл 1 мл
Кофеиновый реактив 3,5 мл 3,5 мл
Диазореактив 0,5 мл 0,5 мл
Физиологический раствор 0,5 мл 3,5 мл
Типы билирубина общий контроль прямой (связанный)

Нормальное содержание билирубина в крови –8,5 – 20,5 мкмоль/л; 75% общего билирубина составляет непрямой (свободный), 25% — прямой (связанный) билирубин.

Клинико-диагностическое значение определения содержания билирубина в сыворотке крови:определение общего билирубина и его фракций используется для диагностики и дифференциальной диагностики желтух различной этиологии – гемолитической (надпеченочной), паренхиматозной (гепатоцеллюлярной, печеночной) и обтурационной (механической, подпеченочной). При гемолитической желтухе гипербилирубинемия развивается в основном за счет непрямого (свободного) билирубина. При паренхиматозной желтухе происходит деструкция гепатоцитов и нарушается экскреция прямого билирубина в желчные ходы, он попадает в кровь. Кроме того из-за функциональной несостоятельности гепатоциты не способны эффективно захватывать из крови непрямой билирубин и конъюгировать его. При паренхиматзной желтухе наблюдается гипербилирубинемия смешанного типа. При обтурационной желтухе нарушается эвакуация желчи в двенадцатиперстную кишку, что приводит к повышению в крови прямого, а в более поздние сроки болезни и непрямого билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Для студента самое главное не сдать экзамен, а вовремя вспомнить про него. 10453 — | 7708 — или читать все.

источник

Лабораторная работа № 14 Количественное определение общего билирубина в сыворотке крови по методу Ендрассика и Клехгорна.

Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина в сыворотке крови.

Мотивация: Билирубин  продукт ферментативного окисления гемоглобина (конечный продукт распада гема), образующийся в результате естественного распада эритроцитов в клетках РЭС, относится к группе желчных пигментов. Билирубин  вещество токсичное, т.к. молекула билирубина является гидрофобной и может проникать в клетки головного мозга. Поэтому в организме человека существуют реакция обезвреживания билирубина, которая протекает в печени.

где УФДГК  кофермент уридиндифосфат глюкуроновая кислота, УДФГТ  фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.

Билирубиндиглюкуронид экскретируется с желчью в ЖКТ, где высвобождается из коньюгата, восстанавливается до уробилиногена, затем превращается в стеркобилиноген, в форме которого и выводится из организма человека.

Принцип метода: в основе определения билирубина лежит реакция азосочетания билирубина с диазосмесью Эрлиха, в результате которой появляется малиновокрасная окраска за счет образующегося азобилирубина. Концентрация последнего определяется фотоколориметрически.

Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно (прямой билирубин по старой терминологии), тогда как свободный билирубин неустойчив в растворе в сильно кислой среде, при которой происходит реакция азосочетания и требует присутствия стабилизатора, роль которого могут играть кофеин, спирт, мочевина, ацетат, бензонат натрия и др. (непрямой билирубин).

1. Химические пробирки, бюретки, пипетки на 10мл и 1 мл; 2. Раствор сульфаниловой кислоты 0,5%; 3. Раствор нитрита натрия 0,5% (готовится еженедельно); 4. Кофеиновый реактив: кофеина чистого 5г, бензойнокислого натрия – 37,5г, уксуснокислого натрия – 62,5г, растворяются при нагревании: раствор доводится дистиллированной водой до 1л; 5. Сыворотки крови с различными концентрациями билирубина.

Ход работы: в химическую пробирку из бюреток отмеривают 1 мл сыворотки и 2,5 мл кофеинового реактива. Диазосмесь готовят в одной пробирке на всю группу следующим образом: 10 мл 0,5% раствора сульфаниловой кислоты и 0,25мл 0,5% нитрита натрия отмеривают пипеткой в пробирку из склянки на столе преподавателя. Готовую диазосмесь отмеривают пипеткой по 0,5мл в каждую пробу с сывороткой. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на 20 минут в темноту, затем фотометрируют с зеленым светофильтром (длина волны 530 нм), в кюветах 10 мм против контрольной пробы, в которой вместо сыворотки используют 1 мл дистиллированной воды.

Х= (6,34Д) – 0,05 = мг% 17,1 = мкмоль/л

где D – оптическая плотность

0,05 – поправка на окраску диазосмеси с кофеиновым реактивом

17,1 –коэффициент перерасчета в единицах СИ

Клинико-диагностическое значение определения

общего билирубина в сыворотке крови

В крови здорового человека уровень общего билирубина равен 8,5  20,5 мкмоль/л (0,4  0,8 мг/дл), причем около 75% этого количества приходится на долю непрямого билирубина (6,4  15,4 мкмоль/л).

Повышение содержания общего билирубина более 20,5 мкмоль/л называется гипербилирубинемией и является симптомом различных физиоло-гических и патологических состояний. Гипербилирубинемия более 3035 мкмоль/л сопровождается желтушной окраской склер и кожных покровов.

Физиологическая гипербилирубинемия  это так называемая неонаталь-ная физиологическая желтуха новорожденных. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, что является следст-вием с одной стороны интенсивного гемолиза эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин (НbF), а с другой стороны, следствием незрелости гепатоцитов по захвату, коньюгации и экскреции коньюгированного билирубина.

Патологическая гипербилирубинемия может быть вызвана различными причинами, например:

 гемолитическая гипербилирубинемия (гемолитическая желтуха) является следствием массивного гемолиза эритроцитов. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, при возможном повыше-нии и коньюгированного (прямого) билирубина. В свою очередь причины гемолиза делятся на биологические (малярия, переливание крови несовмести-мой по группе или резус-фактору) и химические (действие сильных окислите-лей и других тиоловых ядов, врожденные заболевания с гемолизом, например гемоглобинопатии (серповидноклеточная анемия) и энзимопатии (в частности по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе и метгемоглобинредуктазе).

 врожденная неконьюгированная гипербилирубинемия (врожденная неге-

молитическая желтуха) является следствием метаболического дефекта в коньюгации билирубина за счет отсутствия или крайней низкой активности УДФГТ, что наблюдается при синдроме КлиглераНайяра и синдроме Жильбера. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина.

 токсическая гипербилирубинемия (паренхиматозная желтуха) является следствием поражения клеток печени вирусами (вирус гепатита А, В, С, Д, цитомегаловирус), гепатотропными ядами (хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен, галотан, ацетаминофен (парацетомол), изониазид, рифампицин, -аманитин (токсин бледной поганки) и др.), а также имеет место при циррозе печени (синдром гепатоцеллюлярной недостаточности). Общий билирубин повышен преимущественно за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина. Коньюгированный (прямой) билирубин может быть в норме или повышен (при цитолизе).

 коньюгированная гипербилирубинемия (обтурационная, холестатическая желтуха) является следствием механического препятствия оттоку желчи, что наблюдается при желчно-каменной болезни (калькулезный холецистит) и при наличии опухоли, перекрывающей желчевыводящие пути (опухоль главного желчевыводящего протока, опухоль головки поджелудочной железы и др.). Общий билирубин повышен за счет коньюгированного (прямого) билирубина.

 врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая идиопа-тическая желтуха) является следствием дефекта в экскреции коньюгирован-ного билирубина в желчь. Наблюдается при синдроме Дубина-Джонсона. Общий билирубин повышен за счет прямого билирубина. При гистологи-ческом исследовании ткани печени выявляется меланоз с неидентифицированным пигментом.

 врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая негемо-литическая желтуха) предположительно является следствием нарушения экскреторной функции печени, наблюдается при синдроме Ротора, при гистологическом исследовании ткани печени патологических изменений не находят.

Неконьюгированный билирубин может проходить гематоэнцефалический барьер в случае его повышенного содержания в крови и приводить к пораже-нию мозга (ядерная желтуха). Для предотвращения развития энцефалопатии применяют индукторы УДФГТ (фенобарбитал, люминал), например для коррекции состояния у недоношенных новорожденных детей.

Тестовый контроль по теме: Химия крови.

Выберите правильнЫй ответ

Непрямой билирубин превращается в прямой билирубин связываясь:

а) с сывороточным альбумином

б) в печени с бензойной кислотой

в) в печени с ФАФС (3-фосфоаденин 5-фосфосульфат)

г) в печени с уридинфосфоглюкуроновой кислотой (УДФ ГК)

Выберите правильнЫй ответ

Причиной порфирий является:

б) нарушение синтеза глобина

в) нарушение синтез билирубина

г) нарушение образования в кишечнике уробилиногена, стеркобилино-гена и стеркобилина

д) нарушение проницаемости мембран эритроцита

Выберите правильнЫй ответ

б) 4 полипептидных цепей -1,-2,-1, -2, соединенного с 4 молекулами гема

в) 1 полипептидной цепи, соединенной с одной молекулой гема

г) 2 полипептидных цепей, соединеных с 2 молекулами гема

д) 2 полипептидных цепей, соединенных с 1 молекулой гема

Выберите правильнЫй ответ

Причина серповидной клеточной анемии:

а) нарушение процесса всасывания железа

в) изменение в результате мутации первичной структуры полипептидной цепи

г) изменена вторичная структура -1, -2, -1, -2 цепей

д) изменена третичная структура -1, -2, -1, -2

источник

Печень и анализы

Количественное определение пировиноградной кислоты в моче.

Принцип метода. Пировиноградная кислота является одним из промежуточных продуктов углеводного обмена. Пировиноградная кислота взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде, образуя 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты желто-оранжевого цвета, интенсивность окрашивания которых пропорциональна концентрации пировиноградной кислоты.

Гидразоны α-кетоглутаровой, щавелевоуксусной, дегидроаскорбиновой кислот в щелочной среде нестойки и быстро разлагаются.

Ход работы. Контрольная и опытная пробы ставятся одновременно, пользуются сухой химической посудой. Берут 2 пробирки: в контрольную наливают 1мл воды в опытную 1 мл мочи. Зачем в обе пробирки приливают по 1 мл 2,5% спиртового раствора КОН, перемешивают в течение 1 минуты, а затем приливают по 0,5мл 0,1 % раствора 2,4-динитрофенилгидразина и оставляют стоять на 15 минут при комнатной температуре. Колориметрируют на ФЭК против контроля на реактивы (проба с водой) в кювете толщиной 5мм с синим светофильтром. Расчеты выполняют по калибровочному графику, при этом находим содержание ПВК в моче в мкг/мл. Найденную величину умножаем на суточный диурез (1500 мл для мужчин и 1200 мл для женщин) и получаем содержание ПВК в суточной моче. В норме экскреция ПВК с мочой составляет 10-25 мг в сутки (113,7-283,9 мкмоль/сут).

Увеличение выделения ПВК с мочой наблюдается при авитаминозе и гиповитаминозе В1. Содержание ПВК в крови и экскреция с мочой возрастает также при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарноадреналовой системы. При наркозе содержание ПВК в крови, напротив, снижается 4. Количественное определение глюкозы крови. Сахарная кривая.

Для количественного определения глюкозы в крови используются следующие методы:

I. Редуктометрические – они основаны на свойстве сахаров восстанавливать в щелочной среде соли тяжёлых металлов (титрометрический метод Хагедорна-Йенсена). Недостаток этих методов состоит в том, что они неспецифичны, так как присутствующие в крови рецидивирующие вещества, не являющиеся углеводами, также обладают восстанавливающими свойствами (мочевая кислота, глютатион, креатинин), и полученные результаты включают всю сумму восстанавливающих соединений в крови.

II. Колориметрические – базируются на методологии определения в конечной точке. В зависимости от химической природы аналитической реакции эти методы подразделяются на неферментные и ферментные (энзиматические):

1. Неферментные — основаны на определении степени интенсивности окраски соединений, образующихся при взаимодействии глюкозы с определенным веществом (ортотолуидиновый метод; специфичен и точен).

2. Энзиматические методы основаны на каталитическом действии ферментов (глюкозооксидазы и гексокиназы). Применение энзимных реагентов значительно увеличивает специфичность метода. Процедуры, связанные с использованием глюкозооксидазной и гексокиназной реакций, могут быть автоматизированы, что значительно повышает чувствительность и точность способа определения глюкозы.

Клинико-диагностическое значение определения содержания глюкозы в крови. В норме содержание глюкозы в крови у взрослых составляет 3,9 -5,8 ммоль/л или 0,7-1,0 г/л. Увеличение концентрации глюкозы в крови- гипергликемия — наблюдается после приема пищи, содержащей большое количество сахара (алиментарная гипергликемия), при клинически выраженной форме сахарного диабета, остром панкреатите, травмах и опухолях мозга, повышении гормональной деятельности щитовидной железы, коры и мозгового слоя надпочечников, гипофиза, сильном эмоциональном и психическом возбуждении. Уменьшение уровня глюкозы в крови — гипогликемия наблюдается при передозировке или неоправданном назначении инсулина, некоторых формах гликогенозов, нарушении всасывания углеводов, заболеваниях поджелудочной железы, сопровождающихся гиперсекрецией инсулина (инсулиноме и др.), при недостаточной выработке контринсулярных гормонов, длительном голодании и др.

Определение глюкозы в крови по цветной реакции с орто-толуидином.

Принцип метода. Белки крови осаждаются трихлоруксусной кислотой и отделяются центрифугированием. Центрифугат обрабатывается орто-толуидиновым реактивом.

Глюкоза при нагревании с о-толуидином в кислой среде дает зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в крови и определяется колориметрически на ФЭКе.

Ход определения. В центрифужную пробирку налить 0,9 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и выдуть на стенку пробирки 0,1 мл крови, взятой из пальца. Содержимое пробирки взболтать и центрифугировать 5-7 мин при 1500 об/мин.

Взять две пробирки. В первую (опыт) прилить 0,5 мл центрифугата, во вторую (контроль) — 0,5 мл 3% раствора трихлорукусусной кислоты и в обе пробирки добавить по 4,5 мл 0-толуидинового реактива. Пробирки поместить на 8 мин (точно!) в кипящую водяную баню и сразу охладить под водопроводной водой до комнатной температуры.

Опытную пробу колориметрировать против контроля или дистиллированной воды на ФЭКе в кювете толщиной слоя 10 мм при красном (600-650 нм) или желтом (595 нм) светофильтре.

Расчет произвести по калибровочному графику или с применением стандартного раствора глюкозы.

Стандартная проба. Стандартную пробу проводят как опытную, но вместо крови используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (1,0 г/л), а в случае высокого содержания сахара в крови 16,65 ммоль/л (3,0 г/л) или 27,75 ммоль/л (5,0 г/л).

Соп = (Сст × Еоп) / Ест = ммоль/л глюкозы или г/л глюкозы, где

Соп — концентрация глюкозы в опытной пробе в ммоль/л или г/л,

Сст — концентрация глюкозы в стандартной пробе в ммоль/л или г/л,

Еоп — оптическая плотность опытной пробы,

Ест — оптическая плотность стандартного раствора глюкозы

Сахарная кривая — Суть метода заключается в измерении у пациента уровня глюкозы крови натощак, затем в течение 5 минут предлагается выпить стакан теплой воды, в котором растворена глюкоза (75 грамм, у детей 1,75г. на кг. массы тела). через 2 часа вновь измеряют уровень сахара в крови.

источник

Качественное определение «прямого» и «непрямого» билирубина в сыворотке крови

Билирубин образуется в организме в результате распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень, селезенка). Из тканей билирубин поступает в кровь, и как соединение токсичное захватывается печенью, где и обезвреживается путем соединения его с глюкуроновой кислотой, образуя моно- и диглюкурониды. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком.

В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый «непрямой» (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый «прямой» (диглюкуронид билирубина). Вместе обе формы составляют общий билирубин.

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая дает со связанным билирубином (хорошо растворимым в воде) розово-фиолетовое окрашивание, а «непрямой» билирубин, в присутствии спирта (спирт переводит «непрямой» билирубин в растворимое состояние) – красно-розовое.

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив (свежеприготовленный). 3. Этиловый спирт. 4. Фильтровальная бумага.

А) Обнаружение «прямого» билирубина. На часовое стекло, под которое подложен лист белой бумаги, наносят каплю сыворотки крови, содержащей «прямой» билирубин, добавляют 3 капли свежеприготовленного диазореактива и перемешивают стеклянной палочкой. Образуется характерное для билирубина розово-фиолетовое окрашивание.

Б) Обнаружение «непрямого» билирубина. В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови, 2 мл этилового спирта и фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива – появляется красно-розовое окрашивание.

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты и сделайте выводы.

Контрольные вопросы

  1. Где и из чего в организме человека образуется билирубин?
  2. Что означают термины «прямой» и «непрямой» билирубин?
  3. Каким путем билирубин выделяется из организма человека?

Лабораторная работа №28

Количественное определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови

В крови билирубин содержится в небольших, но постоянных количествах: 8-20 мкмоль/л. В сыворотке крови содержатся две формы билирубина – связанный, или билирубинглюкуронид, хорошо растворимый в воде, и несвязанный, или свободный билирубин, плохо растворимый в воде. Свободная форма его циркулирует в крови в виде комплекса с альбумином. У здоровых людей 75% общего билирубина сыворотки крови составляет свободный билирубин.

В клинической практике чаще всего приходится встречаться с гипербилирубинемиями различного происхождения. Повышение уровня свободного билирубина в крови встречается при гемолитических желтухах, некоторых анемиях, желтухе новорожденных и др. Желтухи, связанные с затруднением оттока желчи (механические), сопровождаются повышением уровня глюкуронида билирубина («прямой»). При паренхиматозных желтухах наблюдается также повышение содержания глюкуронида билирубина, с преобладанием однако моноглюкуронида.

Принцип метода. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности окрашивания последнего фотометрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между содержанием общего и связанного билирубина находят количество свободного.

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив I. 3. Диазореактив II. 4. Кофеиновый реактив. 5. Физиологический раствор хлорида натрия.

Перед работой готовят диазосмесь: смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II. В три пробирки (1 – для определения уровня общего билирубина, 2 – связанного билирубина и 3 – контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме:

Реактив, мл Общий билирубин Конъюгированный (связанный) билирубин Контрольная проба
Сыворотка 0,25 0,25 0,25
Кофеиновый реактив 1,75 1,75
Физиологический раствор 1,75 1,75
Диазосмесь 0,25 0,25

При определении уровня общего билирубина пробу оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. В дальнейшем окраска пробы не изменяется. Для установления содержания коньюгированного (связанного) билирубина колориметрирование осуществляют спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии пробы в реакцию вступает свободный билирубин.

Колориметрируют опытные пробы против контроля при зеленом светофильтре (500–560 нм) в кювете шириной 5мм. Оценку результатов производят по калибровочному графику. В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л, 75% его количества приходится на долю свободного билирубина.

Калибровочный график для определения билирубина крови

Указания к оформлению лабораторной работы

В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований впишите нормальные значения концентрации билирубина в крови.

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты – концентрации общего и конъюгированного билирубина и сделайте выводы о причинах возможного отклонения этих показателей от нормы в исследуемом материале.

Контрольные вопросы

  1. Назовите нормальную концентрацию билирубина в крови человека.
  2. Перечислите причины гипербилирубинемии.
  3. Для каких целей в клинике определяют количественное содержание билирубина в крови человека?

Лабораторная работа №29

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; Нарушение авторского права страницы

источник