Метод определения билирубина и его фракций

Спектрофотометрический метод определения общего билирубина

и его фракций (метод Эбер-Лейна).

Измерение характерного для билирубина максимума абсорбции при 450 нм после фракционирования билирубина в фосфатном буфере, этилацетате и бутиловом спирте.

1. Однозамещенный фосфат натрия (NaH2PO4), 0,2 моль/л.

3. Фосфатный буфер рН 5,0; 0,2 моль/л раствор NaH2PO4 доводят до необходимого рН раствором едкого натра 5 моль/л.

6. Билирубин-эталон лиофилизированный.

Материал для исследования.

Сыворотка крови, свободная от гемолиза.

Ход определения. В 2 центрифужные пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. В первую приливают 1,8 мл фосфатного буфера и 3 мл этилацетата, во вторую — 2,2 мл фосфатного буфера и 3 мл бутанола. Пробирки закрывают, энергично встряхивают и центрифугируют 5— 10 мин, после чего все три образовавшихся слоя переносят осторожно в кюветы спектрофото­метра для измерения. Этилацетатный экстракт содержит свободный билирубин, бутаноловый экстракт — свободный билирубин и моноглюкуронид, буферный водный слой — диглюкуронид. Каждую пробу измеряют при 450 и 575 нм (из­мерение при 575 нм проводят для исключения поглощения за счет гемоглобина).

Из значения экстинкции при 450 нм вычи­тают значение экстинкции при 575 нм. Даль­нейший расчет производят по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой можно использовать «Билирубин-эталон лиофилизированный» (), из которого готовят рабочие калибровочные растворы раз­ной концентрации согласно инструкции. Из каж­дого раствора берут по 0,2 мл и добавляют соот­ветствующий растворитель (этилацетат, п-бутанол, фосфатный буфер). Калибровочные пробы обрабатывают и измеряют при тех же условиях, что опытные пробы.

Непрямореа­гирующий билирубин и моноглюкуронид били­рубина определяют в бутаноловом экстракте; в этилацетатном экстракте определяют непрямо­реагирующий билирубин; в фосфорно-буферном слое — диглюкуронид билирубина; моноглюкуронид билирубина определяют по разнице содер­жания билирубина в бутаноловом и этилацетат­ном экстрактах.

Нормальные величины те же, что в унифицированном методе.

Литература. Eberlein W. R. Pediatrics, 1960, vol. 25, p. 878.

Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л (2,5 мг/100 мл). Предложены различные классификации патоло­гических желтух, при которых в зависимости от механизма их возникновения повышаются раз­личные фракции билирубина.

Заболевания, вызывающие повышение свя­занного прямореагирующего билирубина: ви­русный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия, синдром Дубина—Джонсона.

Заболевания, вызывающие повышение не­связанного непрямореагирующего билирубина: гемолитическая анемия, пернициозная анемия; несвязанный билирубин бывает также повышен при желтухе новорожденных, болезни Жиль­бера, синдроме Криглера—Найяра, синдроме Ротора.

При механической желтухе связанный с глюкуроновой кислотой билирубин увеличивается в основном за счет билирубиндиглюкуронида, при паренхиматозной желтухе — билирубин- моноглюкуронида. Прямореагирующий билиру­бин при гемолитической желтухе новорожден­ных состоит глав

источник

Билирубин и его фракции

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции

Принцип

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

Клинико‑диагностическое значение

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

источник

Лабораторная диагностика. Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфониевая кислота, которая реагирует со связанным билирубином и дает красное окрашивание. По интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он также вызывает красное окрашиваниераствора. По интенсивности последнего определяют концентрацию общего билирубина. Свободный билирубин равен разнице между общим и связанным.

Ход определения. В три пробирки (для определения уровня общего билирубина, связанной фракции и постановки контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме (табл.2.).

Данные для определения уровня билирубина в сыворотке крови

Колориметрируют пробы при зеленом светофильтре (500-560 нм); применяют кювету с шириной слоя 5 мм. Оценку результатов проводят по калибровочному графику, построенному в соответствии с инструкцией к наборам реагентов «Билирубин – эталон» фирмы «Лахема».

Находят содержание общего и связанного билирубина в мкмоль/л. Для определения уровня свободной фракции из цифр общего билирубина вычитают показатель конъюгированного.

В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л. 75% его количества приходится на долю свободной фракции.

Средние величины содержания в плазме общего, конъюгированного и свободного билирубина составляют соответственно 11,12; 2,57 и 8,56 мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение исследования

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Билирубин и его фракции (общий, прямой, непрямой)

Анализ, в ходе которого определяется содержание в крови желчных пигментов и их фракций. Они являются метаболитами распада гемоглобина, и их уровень повышается при усиленном разрушении эритроцитов, нарушении функции печени и желчевыводящих путей.

Результаты исследований выдаются с бесплатным комментарием врача.

Колориметрический фотометрический метод.

Мкмоль/л (микромоль на литр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную, капиллярную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не принимать пищу в течение 12 часов до анализа.
• Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение за 30 минут до анализа.
• Не курить в течение 30 минут до анализа.

Общая информация об исследовании

Билирубин – желтый пигмент, который является компонентом желчи и образуется в селезенке и костном мозге при распаде эритроцитов. В норме эритроциты разрушаются через 110-120 дней после выхода из костного мозга. При этом из погибших клеток высвобождается металлопротеин гемоглобин, состоящий из железосодержащей части – гема и белкового компонента – глобина. От гема отщепляется железо, которое повторно используется в качестве необходимого компонента ферментов и других белковых структур, а гемовые белки превращаются в билирубин. Непрямой (неконъюгированный) билирубин с помощью альбуминов доставляется кровью в печень, где благодаря ферменту глюкуронилтрансферазе соединяется с глюкуроновой кислотой и образует прямой (конъюгированный) билирубин. Процесс превращения водонерастворимого билирубина в водорастворимый называется конъюгацией. Связанная фракция пигмента практически не поступает в кровь и в норме экскретируется с желчью. Билирубин в просвете кишечника под действием бактерий кишечника метаболизируется и выводится с калом, придавая ему темную окраску.

Прямой билирубин назван так в связи с методикой лабораторного исследования. Данный водорастворимый пигмент непосредственно взаимодействует с реактивами (диазореактивом Эрлиха), добавленными в пробу крови. Неконъюгированный (непрямой, свободный) билирубин нерастворим в воде, и для его определения необходимы дополнительные реактивы.

В норме за сутки в человеческом организме вырабатывается 250-350 мг билирубина. Выработка более 30-35 мкмоль/л проявляется желтушностью кожных покровов и склер. По механизму развития желтухи и преобладанию фракций билирубина в крови выделяют надпеченочную (гемолитическую), печеночную (паренхиматозную) или подпеченочную (механическую, обтурационную) желтуху.

При повышенном разрушении эритроцитов (гемолизе) или нарушенном захвате печенью желчного пигмента увеличивается содержание билирубина за счет неконъюгированной фракции без повышения уровня связанного пигмента (надпеченочная желтуха). Данная клиническая ситуация наблюдается при некоторых врожденных состояниях, связанных с нарушением конъюгации билирубина, например при синдроме Жильбера.

При наличии преграды на пути выхода желчи в двенадцатиперстную кишку или нарушениях желчевыделения в крови повышается прямой билирубин, что нередко является признаком обтурационной (механической) желтухи. При обструкции желчевыводящих путей прямой билирубин попадает в кровь, а затем и в мочу. Он является единственной фракцией билирубина, способной выделяться почками и окрашивать мочу в темный цвет.

Увеличение билирубина за счет прямой и непрямой фракции указывает на заболевание печени с нарушением захвата и выделения желчных пигментов.

Повышение непрямого билирубина нередко наблюдается у новорождённых в первые 3 дня жизни. Физиологическая желтуха связана с повышенным распадом эритроцитов с фетальным гемоглобином и недостаточной зрелостью ферментных систем печени. При затянувшейся желтухе у новорождённых необходимо исключать гемолитическую болезнь и врожденную патологию печени и желчевыводящих путей. При конфликте групп крови матери и ребенка возникает повышенный распад эритроцитов малыша, что приводит к повышению непрямого билирубина. Неконъюгированный билирубин обладает токсическим действием на клетки нервной системы и может привести к повреждению головного мозга новорожденного. Гемолитическая болезнь новорождённых требует немедленного лечения.

У 1 из 10 тысяч младенцев выявляется атрезия желчевыводящих путей. Данная угрожающая жизни ребенка патология сопровождается повышением билирубина за счет прямой фракции и требует срочного хирургического вмешательства и в некоторых случаях трансплантации печени. У новорождённых также существует вероятность наличия гепатита с повышением как прямого, так и непрямого билирубина.

Изменения уровня фракций билирубина в крови с учетом клинической картины позволяют оценить возможные причины желтухи и определиться с дальнейшей тактикой обследования и лечения.

Для чего используется исследование?

• Для дифференциальной диагностики состояний, сопровождающихся желтушностью кожных покровов и склер.
• Для оценки степени гипербилирубинемии.
• Для дифференциальной диагностики желтух новорождённых и выявления риска развития билирубиновой энцефалопатии.
• Для диагностики гемолитической анемии.
• Для исследования функционального состояния печени.
• Для диагностики нарушений оттока желчи.
• Для наблюдения за пациентом, принимающим препараты с гепатотоксическими и/или гемолитическими свойствами.
• Для динамического наблюдения за пациентами с гемолитической анемией или патологией печени и желчевыводящих путей.

Когда назначается анализ?

• При клинических признаках патологии печени и желчевыводящих путей (желтуха, потемнение мочи, обесцвечивание стула, зуд кожных покровов, тяжесть и боли в правом подреберье).
• При обследовании новорождённых с выраженной и затянувшейся желтухой.
• При подозрении на гемолитическую анемию.
• При обследовании пациентов, регулярно употребляющих алкоголь.
• При использовании лекарственных препаратов с вероятным гепатотоксическим и/или гемолитическим побочным действием.
• При инфицировании вирусами гепатитов.
• При наличии хронических заболеваний печени (цирроз, гепатит, холецистит, желчнокаменная болезнь).
• При комплексном профилактическом обследовании пациента.

источник