Определение билирубина по диазореакции

Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа).

Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный — после добавления кофеинового реактива.
Реактивы: кофеиновый реактив. 5 г чистого кофеина, 7,5 г натрия бензоата, 12,5 г натрия ацетата растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50—60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят дистиллированной водой до 100 мл. Срок хранения 2 нед;
натрия хлорид (ч. д. а. или х. ч.), 154 моль/л. 0,9 г натрия хлорида помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой до метки. НС1 концентрированная (ч. д. а., х. ч.); сульфаниловая кислота (ч. д. а.);
диазореактив I. 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 мл дистиллированной воды, прибавляют 15 мл концентрированной НС1 (плотность 1,19 кг/м3). Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после полного растворения сульфаниловой кислоты и охлаждения раствор доливают дистиллированной водой до 1 л. Реактив стойкий, хранят в посуде из темного стекла;
диазореактив II. Натрия нитрит (№N02, ч. д. а., х. ч.), 5 г/л (0,07 моль/л). 0,5 г натрия нитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Реактив стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II;
билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать наборы отечественных или зарубежных фирм, содержащие билирубин высокой степени чистоты. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора;
натрия карбонат, 0,1 моль/л. 10,6 г безводного №гСОз растворяют и доводят до 1 л дистиллированной водой;
уксусная кислота, 4 моль/л. 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы мерные.
Ход определения. ВЗ пробирки (для общего и связанного билирубина и для контроля) вносят реактивы, как указано в таблице 16.

1. Смеси реактивов для определения билирубина в сыворотке крови

Для определения связанного билирубина измерение на фотоэлектроколориметре проводят через 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин.

Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 мин, после чего измеряют на ФЭКе. В дальнейшем окраска не изменяется.
Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при колориметрировании общего и связанного билирубина, вычитают показатель контроля.
Расчет ведут по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина. Для определения уровня непрямого билирубина вычитают из показателя общего его содержания показатель прямого билирубина.
Способ 1. Калибровочный график строят по способу Шелон- га—Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови.
Реактивы для построения калибровочного графика. 1. Основной раствор билирубина. Препараты кристаллического билирубина отличаются по своим свойствам. Не каждый билирубин может быть использован для построения калибровочного графика. Допустим лишь тот билирубин, 1 мг%-ный раствор которого при растворении в хлороформе (для наркоза) при 25 °С дает на спектрофотометре абсорбцию от 1,01 до 1,07 при длине волны 453 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
В колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина (имеющийся в продаже билирубин является непрямореагирую- щим) в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия (10,6 г безводного Иа2СОз доводят до 1 л дистиллированной водой) и хорошо перемешивают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором ИагСОз и несколько раз перемеши

вают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем билирубин окисляется.

1. Рабочий раствор билирубина. К 13,9 мл свежей негемолизи- рованной сыворотки крови добавляют 2 мл свежеприготовленного раствора билирубина и 0,1 мл (4 моль/л) раствора уксусной кислоты (25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой). Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Он содержит на 10 мг% билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке крови, при измерении на ФЭКе из величины экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для приготовления компенсационной жидкости смешивают

1. мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мг 0,1 моль/л раствора ИагСОз и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина (табл. 17).
17. Разведения билирубина для построения калибровочного графика

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора натрия гидроксида. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин. Из компенсационной жидкости готовят разведения аналогично калибровочным (см. табл. 17) и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.
Способ 2. Калибровочный график строят по готовым наборам реактивов, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами. Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.
Подбор реактивов в коммерческих наборах основан также на диазореакции, положенной в основу метода Ендрассика—Клеггор- на—Грофа.
Примечание. Сыворотка или плазма крови должны быть свежими, свободными от гемолиза, прозрачными. Плазму или сыворотку крови хранят не более двух дней при температуре 4—25 °С. Исследования проводят незамедлительно. Образцы крови защищают от света.
Источник: 43.

источник

Унифицированный метод определения билирубина по диазореакции (метод Ендрассика-Грофа)

Принцип метода: Под воздействием НСI разрывается связь билирубина и образуется два дипиррола, которые диазотируются диазобензо сульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 125 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до 50-60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят водой до 100 мл.

5. Натрия хлорид: 154 ммоль/л (изотонический раствор: 0,9 г хлорида натрия в 100 мл воды.

8. Диазосмесь. Диазореактив 1: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300-400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСI, раствор доливают до 1 л. Диазореактив 2: натрия нитрит 5г/л: 0,5 г нитрита натрия в 100 мл воды. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива 1 и 0,3 мл диазореактива 2.

9. Билирубин для построения калибровочного графика 800 мг/л.

10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного Na₂СО₃ растворяют и доводят до 1 л водой.

11. Уксусная кислота, 4 моль/л; 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл водой.

Ход определения: В три пробирки: две опытные и одну холостую вносят реактивы: по 0,5 мл сыворотки крови, кофеиновый реактив вносят в первую опытную пробирку для определения общего билирубина и в холостую пробу по 1,75 мл, во вторую опытную не вносят. Затем во вторую опытную (это определение связанного билирубина) прибавляют 1,75 мл и в холостую пробу 0,25 мл раствора хлорида натрия. Вносят диазосмесь в первую и во вторую опытные пробирки по 0,25 мл.

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5-10 минут после добавления диазосмеси, при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 минут, после чего измеряют на ФЭК при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику.

Основной раствор билирубина: в колбе на 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30-35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na₂СО₃ и несколько раз перемешивают, доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором карбоната натрия.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. Этот раствор содержит на 100 мг/л билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для ее приготовления смешивают 13,9 мл той же сыворотки, 2мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 минут.

Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным: в 5 пробирок прибавляют 0,05 мл; 0,1 мл; 0,15 мл; 0,2 мл; 0,25 мл рабочего раствора билирубина, добавляют с первой по пятую: 0,45 мл; 0,4 мл; 0,35 мл; 0,3 мл; 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия. В пробах количество билирубина соответствует с первой по пятую пробирки: 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025 мг. Концентрация билирубина в сыворотке крови: 17,1 мкмоль/л; 34,2 мкмоль/л; 51,3 мкмоль/л; 68,4 мкмоль/л; 85,5 мкмоль/л.

Нормальные величины. В сыворотке крови содержится 8,5-20,5 мкмоль/л общего билирубина, из которого 75% приходится на долю свободного билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Да какие ж вы математики, если запаролиться нормально не можете. 8704 — | 7532 — или читать все.

источник

Билирубин и его фракции

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции

Принцип

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

Клинико‑диагностическое значение

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

источник

ДИАЗОРЕАКЦИЯ

ДИАЗОРЕАКЦИЯ (син. диазореакция Эрлиха) — цветная реакция между реактивом Эрлиха (диазофенилсульфоновой кислотой) и рядом органических веществ, способных реагировать с ароматическими диазосоединениями (пиррол, крезол, индикан и др.); используется в общей и клинической биохимии и гистохимии. Предложена П. Эрлихом в 1882 г. П. Эрлих в 1883 г. указал, что билирубин вступает в соединение с диазониевыми солями, давая характерное красное окрашивание.

Широкое применение Д. получила в клинике именно при качественном и количественном определении билирубина (см.). Диазореактив используется также для определения тирозина (см.), гистидина (см.) и гистамина (см.). Белки, в молекулу которых входят аминокислоты тирозин, триптофан и гистидин, дают с диазореактивом оранжево-красное окрашивание.

Диазореактив готовят непосредственно перед употреблением смешиванием двух р-ров — 0,15—0,5% р-ра сульфаниловой к-ты в разбавленной соляной к-те и 0,5% р-ра азотистокислого натрия, в результате чего происходит следующая реакция:

Вещества, дающие с диазофенилсульфоновой к-той цветную реакцию, замещают в ней атом хлора, результатом чего является образование окрашенного азосоединения.

При определении некоторых веществ в качестве компонента для получения окрашенного диазосоединения употребляется не сульфаниловая к-та, а другие ароматические амины, напр, при определении фенолов в крови и в моче — n-нитроанилин, при определении сульфаниламидов— 2R-кислота и т. д.

Диазореакция в моче

В норме Д. в моче отрицательна. В случае положительной реакции при добавлении диазореактива и аммиака появляется карминово-красное окрашивание (П. Эрлих, 1882). Д. в моче высокоспецифична для билирубина, другие желчные пигменты (см.) в моче не дают подобной реакции. Алкалоиды опия, сульфаниламиды, салол, сальварсан, ревень, нафталин, креозот, выделяющиеся с мочой, могут давать сходную цветную реакцию.

Ход определения

К 10 мл свежеприготовленного диазореактива прибавляют 10 мл свежей мочи, смешивают, приливают 2 мл аммиака (NH₄OH) лочной реакции и хорошо встряхивают. При положительной реакции появляется розовое или карминово-красное окрашивание. Реакция считается положительной, если окрашена не только жидкость, но и образовавшаяся пена. Желтая или оранжевая окраска свидетельствует об отрицательной реакции. Сомнительную Д. нужно признать отрицательной. Интенсивность Д. оценивается количественно путем сравнения с окраской, образующейся в результате Д. со стандартным р-ром нафтолсульфокислого натрия. Хантер (G. Hunter, 1930), используя принцип Д., увеличил точность определения билирубина в моче путем предварительного осаждения его хлористым барием. Реакция проводится следующим образом: к 10 мл подкисленной мочи добавляют 4 мл 10% BaCl₂, перемешивают, центрифугируют, осадок промывают дист, водой, затем в пробирку последовательно добавляют 0,5 мл реактива Эрлиха, 2 мл 96 % спирта и 0,3 мл 6% двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь повторно центрифугируют. В присутствии билирубина надосадочная жидкость окрашивается в розовый цвет. Чувствительность метода 1 : 666 000. Иногда вместо реактива Эрлиха в этой реакции используют натрий изопаранитродиазобензол.

Однако, несмотря на специфичность и высокую чувствительность, Д. для определения билирубина в моче имеет свои недостатки. Ее точность зависит от степени свежести мочи, температуры мочи и ее прозрачности (мутную мочу приходится фильтровать), метод относительно трудоемок. Поэтому Д. для определения билирубина в моче не рекомендована в качестве унифицированного метода.

В первой половине 20 в. определению интенсивности Д. в моче придавали очень большое диагностическое и прогностическое значение, однако позднее она стала использоваться только как вспомогательный диагностический тест. Д. бывает почти всегда положительной при инфекционных заболеваниях, сопровождающихся лихорадочным состоянием, особенно при брюшном тифе и кори.

При брюшном тифе Д. обычно положительна уже на 3—4-й день заболевания и остается такой в течение всей болезни. При рецидиве брюшного тифа Д. снова становится положительной, что помогает дифференцировать рецидив с осложнениями болезни. Если при разведении мочи 1 : 50 и более сохраняется положительная Д., это свидетельствует о тяжелом течении заболевания. Раннее исчезновение положительной Д. рассматривается как благоприятный прогностический признак.

При кори положительная Д. в моче часто отсутствует в период высыпания, но почти постоянно обнаруживается на стадии шелушения. При помощи Д. можно отличить корь от краснухи, при к-рой Д. всегда отрицательна.

Помимо этих заболеваний, Д. положительна при ревматизме, рожистом воспалении, пневмонии, милиарном туберкулезе, трихинеллезе. Положительная Д. при туберкулезе легких, как правило, свидетельствует о тяжелом течении заболевания. При некоторых тяжелых инфекционных болезнях (скарлатине, дифтерии и др.) Д. почти всегда отрицательна.

Диазореакция в крови

Диазореакция в крови применяется преимущественно для определения билирубина; практически это является ее важнейшим применением в клинической лабораторной диагностике. Эту реакцию Ван-ден-Берг (A. A. Hijmans van den Bergh) в 1913 г. впервые использовал для качественного и количественного определения билирубина в сыворотке крови (см. Ван-ден-Берга реакция). Наиболее широко в клинике применяется модификация метода Ван-ден-Берга — метод Ендрашика и др. (см. Ендрашика-Клегхорна-Грофа метод).

Библиография Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, М., 1969; Ворожцов H. Н. Основы синтеза промежуточных продуктов и красителей, М.— Л., 1950; Цоллингeр Г. Химия азокрасителей, пер. с нем., Л., 1960.

источник