Определение билирубина в крови фотометрией

фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из bacillus pumilus

Изобретение относится к биотехнологии. Исследуемую сыворотку крови инкубируют в натрий фосфатном буфере, содержащем детергент и фермент, окисляющий билирубин. Измеряют оптическую плотность смеси при 450 нм. При этом в качестве фермента используют термостабильную бактериальную оксидазу из Bacillus pumilus, а концентрацию билирубина в образце рассчитывают по разнице величин оптической плотности контрольной и опытной проб, соотнесенной с калибровочным графиком. При определении концентрации билирубина с использованием калибратора концентрацию (С) билирубина в опытной пробе рассчитывают по формуле: С=(А 2 -А 1 /А 4 -А 3 )×Ск, где A 1 , А 2 — оптическая плотность пробы после инкубации в присутствии и в отсутствие фермента, соответственно; А 3 , А 4 — оптическая плотность калибратора после инкубации в присутствии и в отсутствие фермента, соответственно; Ск — концентрация билирубина в калибраторе. Наблюдаемое в ходе реакции уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 450 нм прямо пропорционально концентрации общего билирубина в сыворотке. Изобретение предоставляет простой и надёжный способ, показывающий высокую точность анализа. 1 ил.

Рисунки к патенту РФ 2418072

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно — к лабораторной диагностике, и может применяться как для диагностических целей, так и терапевтического наблюдения.

Билирубин — один из нескольких желчных пигментов, образуется в ретикулоэндотелии печени и селезенки при распаде гемоглобина. В сыворотке крови билирубин присутствует в виде двух основных форм: конъюгированного (связанного с глюкуроновой кислотой) и неконъюгированного (несвязанного, непрямого или свободного) билирубина. Вместе обе формы билирубина составляют общий билирубин крови. Для лабораторной диагностики используют измерения общего и конъюгированного билирубина. Разница между этими показателями составляет величину неконъюгированного билирубина. Определение концентрации различных форм билирубина в крови позволяет судить о количестве разрушающихся эритроцитов, функции клеток печени и транспорте желчи. В связи с этим разработка простого, надежного и экологически безопасного способа определения концентрации билирубина является актуальной.

Известны несколько способов определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови фотометрическими методами. Наибольшее распространение получили прямой фотометрический метод, биохимический диазометод и ферментативный метод.

Прямой (безреагентный) фотометрический метод основан на поглощении сине-зеленого света билирубином и применяется, главным образом, в педиатрии (Yamanouchi I, Yamauchi Y, Igarashi I. Transcutaneous bilirubinometry: Preliminary studies of noninvasive bilirubin meter in the Okayama National Hospital // Pediatrics. 1980. Vol.65. P.195-202).

Диазометод (метод Йендрашика-Грофа или его модификации; Watson D. Analytic methods for bilirubin in blood plasma //Clin. Chem. 1961. Vol.7. P.603-625) основан на реакции билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой, 3,5-дихлорфенилдиазонием или 2,4-дихлоранилином с образованием окрашенного продукта (диазобилирубина). Интенсивность окраски раствора конечного продукта пропорциональна концентрации общего билирубина и измеряется фотометрически.

Недостатками известных методов являются: прямой метод — неудовлетворительная воспроизводимость в пограничных с патологией концентрациях билирубина (норма для общего билирубина 8,5-20,5 мкмоль/л), диазометод — высокая токсичность исходных реагентов и нестабильность самого диазореагента (при использовании сульфаниловой кислоты — реагент стабилен не более 7 дней при температуре 2-8°С, для дихлоранилина — не более 10 дней при комнатной температуре). Указанные недостатки устранены в ферментативном способе определения билирубина, прототипе заявляемого способа. В известном способе определение концентрации билирубина основывается на реакции окисления билирубина до биливердина ферментом билирубин оксидазой BOX (КФ 1.3.3.5; Otsuji S. et al. A new enzymatic approach for estimating total and direct bilirubin. Clin. Biochem. 1988. Vol.21. P.33-38). Наблюдаемое в ходе реакции уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 450 нм прямо пропорционально концентрации общего билирубина в сыворотке. Благодаря высокой специфичности фермента к билирубину другие компоненты крови не оказывают влияние на величину измерения. Недостатком прототипа является быстрая инактивация известных в настоящее время билирубин оксидаз (активность BOX, выделенной из грибов Myrothecium verrucaria и используемой в коммерчески доступных наборах, снижается уже при температуре выше 37°С и сохраняется не более 5 дней при 5°С, Tanaka N., Murao S. Purification and some properties of bilirubin oxidase of Myrothecium verrucaria MT-1 // Agric. Biol. Chem. 1982. Vol.46, P.2499-2503).

Технической задачей предлагаемого изобретения является использование в ферментативном способе определения общего билирубина в сыворотке крови термостабильной оксидазы из непатогенных почвенных бактерий Bacillus pumilus, обладающей высокоспецифичной билирубин оксидазной активностью.

Поставленная техническая задача достигается тем, что данный фермент выделяется из предварительно сконструированного штамма-продуцента Escherichia coli 109/рВР4. Штамм-продуцент конструируют с помощью стандартных генно-инженерных методов: ген, кодирующий оксидазу, клонируют с помощью ПЦР-метода в векторную плазмиду pUC18. В результате получается рекомбинантная плазмида рВР4. Клетки штамма E.coli 109, содержащие плазмиду рВР4, и есть искомый штамм-продуцент оксидазы — E.coli 109/рВР4. Способ выделения фермента включает: выращивание клеток, инкубирование клеток в присутствии ИПТГ (индуктора экспрессии оксидазы), получение биомассы центрифугированием и разрушение ее ультразвуком, термообработку грубого экстракта при 70°С, хроматографию на анионообменных смолах, концентрирование конечного препарата.

Сущность предлагаемого способа определения концентрации общего билирубина заключается в следующем: 1) тестируемый образец смешивают с раствором фосфатного буфера, содержащего детергент, проводят измерение оптической плотности полученного раствора при 450 нм на любом фотометрическом оборудовании; 2) к смеси добавляют оксидазу, выдерживают 5 мин при 42°С; 3) проводят вторичное измерение оптической плотности раствора при 450 нм. Разность в величине оптической плотности при первом и втором измерениях прямо пропорциональна концентрации билирубина. Расчет проводят с использованием калибратора или калибровочного графика.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Конструирование штамма-продуцента E.coli 109/рВР4.

Клетки бактерий штамма Bacillus pumilus АТСС 7061 (штамм депонирован в ВКМ под номером В508) выращивают в пробирках со средой LB на качалке при 37°С, собирают центрифугированием и из полученной биомассы стандартным способом (обработка фенолом, хлороформом и осаждение этанолом) выделяют хромосомную ДНК. Ген, кодирующий оксидазу (открытая рамка считывания в геноме В. pumilus под номером ВАТ 3525, нуклеотидную последовательность которого можно найти в базе данных GenBank), амплифицируют полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Реакционная смесь содержит выделенную хромосомную ДНК в качестве матрицы и два олигонуклеотидных праймера, содержащих сайты рестриктаз EcoRI и HindIII, комплементарных началу и концу гена, соответственно. ДНК векторной плазмиды pUC18 и ПЦР-продукт подвергают исчерпывающему гидролизу рестриктазами EcoRI и HindIII и затем лигируют. Лигированную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM109. Отбор положительных клонов проводят при помощи ПЦР-анализа с использованием специфических праймеров, с последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК рестриктазами EcoRI и HindIII. В результате получают штамм-продуцент E.coli 109/рВР4.

Пример 2. Выделение оксидазы.

Клетки штамма-продуцента E.coli 109/рВР4 выращивают в среде LB с добавлением ампициллина до 100 мкг/мл в течение 12-14 часов, инокулируют новую порцию питательной среды в соотношении 1:50, растят культуру до мутности 0,8 при 30°С на качалке при 200 об/мин. К культуре добавляют ИГПТ до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию при 25°С при 100 об/мин в течение 3-6 часов. Клетки собирают центрифугированием, осадок суспендируют в буфере (0,05 М натрий фосфатный буфер pH 7,6) из расчета 3,5 мл на 1 г биомассы и подвергают ультразвуковой дезинтеграции на дезинтеграторе (MSE, Англия) при температуре 4-5°С. Суспензию центрифугируют при 15000 об/мин 30 мин на центрифуге J-21 (Beckman, США). Супернатант подвергают термообработке в течение 15 мин при 70°С. Осадок отделяют центрифугированием. Режим центрифугирования, как описано выше. Дальнейшую очистку оксидазы проводят путем хроматографии вначале на Q-сефарозе FF и затем на DEAE-сефарозе FF (Amersham Biosciences). Белок элюируют линейным градиентом 0,1-0,5М NaCl. Пиковые фракции объединяют и концентрируют на мембране (Amicon, 30 kDa). За единицу билирубин оксидазной активности фермента принимают минимальное количество оксидазы, которое в течение 1 мин окисляет 1 мкмоль билирубина при комнатной температуре. Полученный препарат фермента имеет удельную активность по отношению к билирубину 5,6 ед./мг белка и показывает высокую термостабильность (стабилен при 80°С в течение получаса). Полученный препарат фермента сохраняет исходный уровень активности в течение не менее 6 месяцев при температуре 2-8°С.

Пример 3. Определение общего билирубина на спектрофотометре.

а) Приготовление буферного раствора: 0,52 г натрий фосфорнокислый 1-замещенный 2-водный, 3,47 г натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, 0,11 г натрий додецилсульфат (детергент, SDS) растворяют в 100 мл дистиллированной или деионизованной воды. Раствор не токсичен, стабилен при комнатной температуре не менее 1 года. Допускается выпадение осадка (детергента), поэтому перед использованием флакон с буфером следует прогреть при 40-50°С до полного растворения осадка.

б) Проведение измерений: 1) опытная проба — 100 мкл анализируемого образца (сыворотка или белковый раствор калибратора) смешивают с 1000 мкл буферного раствора, добавляют 10 мкл фермента (1000 ед./мл), перемешивают и инкубируют 5 мин при 42°С, проводят измерение оптической плотности при 450 нм на спектрофотометре, в качестве контроля используют воду; 2) контрольная проба — все операции проводят аналогично опытной пробе, но без добавления фермента; 3) концентрацию билирубина в образце рассчитывают путем сравнения разницы между величиной оптической плотности контрольной и опытной проб с калибровочным графиком. При содержании билирубина в сыворотке крови выше 350 мкмоль/л пробу разводят физиологическим раствором, полученный результат умножают на разведение. Калибровочный график строят на основе калибровочных растворов билирубина, приготовленных на растворе альбумина (20 г/л). При определении концентрации билирубина с использованием калибратора (раствор билирубина с известной концентрацией) концентрацию (С) билирубина в опытной пробе рассчитывают по формуле:

где А 2 , А 1 — поглощение опытной пробы после инкубации без и с ферментом, соответственно;

А 4 , А 3 — поглощение калибратора после инкубации без и с ферментом, соответственно;

Сk — концентрация билирубина в калибраторе.

Пример 4. Определение общего билирубина на полуавтоматическом анализаторе.

Способ осуществляют аналогично примеру 3 за исключением того, что количество реагентов и анализируемой пробы следует пропорционально изменить в зависимости от объема используемой кюветы (соотношение сыворотки крови к буферу составляет 1:10).

Пример 5. Для проверки точности предлагаемого способа в качестве анализируемого материала используют контрольную сыворотку (уровень 2, фирма «Вектор-Бест-Европа», Россия) с аттестованным средним значением концентрации общего билирубина, например равным 73,9±4,8 мкмоль/л, измеренным по методу Йендрашика-Грофа. Концентрация общего билирубина, определенная с помощью предлагаемого способа, в данном примере в среднем составляет 71,2±1,7 мкмоль/л. Отклонение от аттестованного значения не превышает 4%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить концентрацию общего билирубина в сыворотке крови на фотометрическом приборе с использованием нетоксичных, стабильных реагентов, при сохранении высокой точности анализа.

В связи с тем, что использование существенных признаков предлагаемого способа в известных научно-технических источниках не обнаружено, можно сделать вывод, что данное техническое решение отвечает критериям изобретения «новизна» и «существенные отличия».

На чертеже представлены данные по линейности определения билирубина, которую оценивают следующим образом: вначале готовят разведения растворов калибратора или сыворотки с известными значениями билирубина (диапазон разведения — 7-244 и 18,5-274 мкмоль/л, соответственно), далее определяют концентрацию билирубина в разведениях предлагаемым способом, затем на основании полученных значений концентраций билирубина строят соответствующий график и рассчитывают уравнение линейной регрессии. На чертеже по оси ординат (у) указаны значения концентраций билирубина, полученные предлагаемым способом, а по оси абсцисс (х) — ожидаемые значения согласно разведению раствора билирубина с известной его концентрацией. Вычисленные уравнения линейной регрессии из графических данных: у=0,971 х+1,292; r=0,998 и у=1,048х-2,626; r=0,995 — для калибратора и сыворотки, соответственно. Высокое значение коэффициента корреляции (r>0,99) в данном диапазоне разведения означает, что линейная область определения билирубина имеет место, по крайней мере, до 274 мкмоль/л. Нижний предел определения — 7,0 мкмоль/л.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ определения концентрации общего билирубина в образцах сыворотки крови, включающий инкубирование анализируемого образца с ферментом, окисляющим билирубин в натрийфосфатном буфере в присутствии детергента, и измерение оптической плотности смеси при 450 нм, отличающийся тем, что в качестве фермента используют термостабильную бактериальную оксидазу из Bacillus pumilus и концентрацию билирубина в образце рассчитывают по разнице величин оптической плотности контрольной и опытной проб, соотнесенной с калибровочным графиком, а при определении концентрации билирубина с использованием калибратора концентрацию (С) билирубина в опытной пробе рассчитывают по формуле
С=(А 2 -А 1 /А 4 -А 3 )·Ск,
где A 1 , А 2 — оптическая плотность пробы после инкубации в присутствии и отсутствии фермента соответственно; А 3 , А 4 — оптическая плотность калибратора после инкубации в присутствии и в отсутствие фермента соответственно; Ск — концентрация билирубина в калибраторе.

источник

Билимет К

Экспортная продукция

БИЛИМЕТ К – портативный анализатор билирубина у новорожденных.

Метод определения: безреагентный — двухволновая фотометрия плазмы крови в стеклянном капилляре. Забор крови производится в стеклянный капилляр без дозирования. Объем крови в полном капилляре примерно 30 мкл. Плазма для фотометрирования получается непосредственно в капилляре на любой гематокритной центрифуге. Анализатор укомплектован гильзами для установки капилляров в центрифугу.

БИЛИМЕТ К определяет оптическую плотность анализируемой плазмы на двух длинах волн с последующим автоматическим пересчетом в концентрацию билирубина.

БИЛИМЕТ К предназначен для использования в родильных домах, в клиниках акушерства и центрах охраны матери и ребенка. Простота процедуры исследования позволяет проводить определение билирубина не только в лаборатории, но и непосредственно в неонатальном отделении.

БИЛИМЕТ К дает возможность значительно снизить травмируемость новорожденных, так как для проведения исследований требуется лишь микродоза капиллярной (или венозной) крови.

БИЛИМЕТ К особенно эффективен для динамического наблюдения за детьми со среднетяжелыми и тяжелыми формами гипербилирубинемии, когда необходимо проводить многократные исследования. Исследование занимает 5-6 минут, что обеспечивает оперативность анализа. Отсутствие необходимости в точном дозировании плазмы упрощает процедуру пробоподготовки и одновременно повышает точность и воспроизводимость измерений. Во многих случаях для контроля гипербилирубинемии успешно используются также анализаторы БИЛИТЕСТ и БИЛИТЕСТ 2000.

Определение концентрации билирубина.

Для определения билирубина анализатором БИЛИМЕТ К не требуются никакие реагенты и никакие дозаторы. Забор крови для исследования производится в стеклянную (гепаринизированную) трубку-капилляр (примерно 30 микролитров), как правило, из пятки ребенка (фото). Для отделения плазмы капилляр помещается на 5 минут в гематокритную центрифугу (фото). Затем капилляр помещается в выдвигающуюся каретку прибора (фото). После нажатия кнопки каретка перемещает капилляр внутрь прибора к фотометрическому датчику, после чего автоматически производится фотометрирование. При перемещении производится автоматическая коррекция параметров оптико-электронного измерительного тракта с помощью встроенных светофильтров. Иными словами, перед каждым измерением прибор «подкалибровывается», что обеспечивает высокую стабильность результатов исследования. Результат измерения может быть выведен на специальное печатающее устройство УП-02 (фото) или на компьютер.

Правильность измерений прибора производится автоматически по встроенному цветному стеклу перед каждым измерением. Никакие другие средства не требуются для контроля работоспособности прибора.

Средство измерения.

БИЛИМЕТ К является средством измерения. Для поверки анализатора используется набор стеклянных мер оптической плотности НОСМОП-9. Поверка производится метрологическими службами, которые должны быть обеспечены этим набором мер. Набор выпускается ЗАО НПП «ТЕХНОМЕДИКА.

Эксплуатация и техническое обслуживание.

БИЛИМЕТ К прост в работе. Его эксплуатация и несложное техническое обслуживание доступны медицинскому персоналу с минимальными требованиями к квалификации.

Обозначение прибора при его заказе и в документации других изделий:

Анализатор билирубина у новорожденных фотометрический капиллярный со встроенной автокалибровкой и безреагентной пробоподготовкой АБФн-04-«НПП-ТМ» ТУ 9443-019-11254896-2004, торговая наименование «БИЛИМЕТ К».

Смотрите также:

БИЛИТЕСТ. Неинвазивный портативный автоматический транскутанный анализатор гипербилирубинемии.

БИЛИТЕСТ 2000. Неинвазивный портативный автоматический транскутанный двухканальный анализатор гипербилирубинемии.

• Метод определения билирубина — безреагентный, двухволновая фотометрия плазмы крови. Длины волн фотометрирования 492 и 523 нм.
• Единица измерения концентрации билирубина – мкмоль/л. Диапазон измерения концентрации общего билирубина крови 0 – 500 мкмоль/л, что соответствует диапазону измерений оптической плотности на двух длинах волн от 0,01 до 1,5 Б.
• Погрешность определения концентрации общего билирубина, обусловленная погрешностью измерения оптической плотности:
  • абсолютная погрешность в диапазоне 0-150 мкмоль/л – 4 мкмоль/л, что соответствует оптической плотности 0,01 Б.
  • относительная погрешность в диапазоне 150-500 мкмоль/л (оптическая плотность от 0,301 до 1,5 -Б) – 3 %.
• Автоматическая коррекция параметров оптико-электронного измерительного тракта с помощью встроенных светофильтров.
• Объем крови для исследования – не более 30 мкл.
• Время фотометрирования – 2 секунды.
• Встроенный оптический инфракрасный канал связи (ИК-связь) для соединения с принтером «Устройством печатающим УП-02-«НПП-ТМ» и с компьютером.
• Электропитание от сети переменного тока с напряжением 220 В и частотой 50 Гц через источник питания

  220 В / = (5,0± 1) В, 0,5 А.

• Время подготовки к работе — 5 с после включения.
• Потребляемая мощность – 1,0 В•А.
• Габариты прибора — 200 х 110 х 70 мм; источника питания – 96 х 95 х 52 мм.
• Масса прибора с источником питания, но без комплекта запасных частей и принадлежностей (ЗИП) — не более 1 кг, в полном комплекте поставки не более 1,2 кг.
• Средний срок службы — не менее 5 лет при средней интенсивности эксплуатации 7 часов в сутки.
• Гарантийный срок 4 года.

Устройство печатающее УП-02:

• Печать на термобумагу шириной 57 мм.
• Сетевое питание — 220 В / 50 Гц (через адаптер).
• Размеры — 240х105х70 мм.
• Инфракрасная связь с анализатором.
• Масса — 1 кг.

Базовый комплект поставки.

Принадлежности

Заключения испытательных медицинских центров.

Отзывы медучреждений и потребителей.

Московская ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова (отзыв)

Золотой знак «Всероссийская марка (III тысячелетие). Знак качества 21 века» (диплом, знак качества)

Direct Spectrophotometric Method for Measurement of Bilirubin in Newborns: Comparison with HPLC and an Automated Diazo Method
(LEICA UNISTAT® — однотипный аналог анализатора Билимет К)
Steven C. Kazmierczak, Alex F. Robertson, Paul G. Catrou, Kimberly P. Briley, Bill L.Kreamer, and Glenn R. Gourley
Clinical Chemistry 48, No. 7, 2002

О переходе на рекомендованные Всемирной Организацией Здравоохранения критерии живорождения и мертворождения
МЗ РФ Приказ N 318, Госкомстат РФ Постановление №190 от 4 декабря 1992 г.
Смотреть: Приложение N 3
Интенсивная терапия и выхаживание новорожденных с очень низкой и экстремально низкой массой тела
(Методические рекомендации)
Раздел Коррекция обменных нарушений

Протокол диагностики и лечения гипербилирубинемии у новорожденных детей
Авторский коллектив:
академик РАМН Н.Н.Володин (руководитель группы), проф., д.м.н. А.Г.Антонов, к.м.н. Е.В.Аронскинд,
проф., д.м.н. Е.Н.Байбарина, проф., д.м.н. Д.Н.Дегтярев, к.м.н. А.В.Дегтярева, проф. д.м.н. О.П.Ковтун,
Ф.Г.Мухаметшин, О.В.Паршикова
Российская ассоциация специалистов перинатальной медицины
Кафедра неонатологии ФУВ РГМУ

Примерный табель оснащения перинатального центра
Приказ Минздравсоцразвития РФ от 09.12.2004 N308
«О вопросах организации деятельности перинатальных центров»
(зарегистрировано с Минюсте РФ 18.01.2005.N6261)

Исследование билирубина у взрослых пациентов методом прямого фотометрирования на анализаторе Билимет К.
Милютин И.А., Ованесов Е.Н., Овчинников И.М., Губайдуллин Б.Х.
ФГУ «5 Центральная поликлиника Минобороны России»,
ЗАО НПП « ТЕХНОМЕДИКА»
Лаборатория. №1, 2009 г. Москва

Гипербилирубинемия (презентация).
Бобин А.О.
Сайт Белорусской медицинской академии последипломного образования

Неонатальные желтухи. (Пособие для врачей)
Н.А.Коровина, А.Л. Заплатников, А.Н.Горяйнова, Е.С. Кешищян, М.И. Пыков, И.И. Рюмина.
Минздрав России. РМАПО, 2004 г.

Фотометрический способ измерения содержания билирубина в крови и устройство для его осуществления.
Ованесов Е.Н., Сецко А.И.,Сецко И.В.
Патент РФ № 2244935

Устройство для безреактивного измерения содержания общего билирубина в крови.
Антонов В.С., Давыдов В.М., Ованесов Е.Н., Прищепа М.И., Сецко И.В., Шибанов А.Н.
Патент РФ № 2035045

источник