Определение билирубина в сыворотке крови биохимия

Определение общего билирубина в сыворотке крови

(метод Иендрашика и Клеггорна)

Принцип метода. Билирубин образуется в организме в результате естественного распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень,селезенка). Билирубин относится к группе желчных пигментов и является токсическим веществом; он обезвреживается в клетках печени. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком. В печени происходит процесс обезвреживания по схеме:

билирубин + УДФ-глюкуроновая кислота билирубин (моно- и диглюкуроид)

Глюкурониды билирубина хорошо растворимы, они выводятся из печени по желчевыводящим путям.

В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый (диглюкуронид ). Вместе обе формы составляют общий билирубин.

Определение содержания билирубина в крови является важным диагностическим тестом. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах-0,5-1,2 мг/дл, причем 75% из них составляет билирубин, связанный с белками (нерастворимый).

При различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия, концентрация билирубина повышается до 30-35 мг/дл.

Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окраски продукта взаимодействия билирубина с диазореактивом. Этот продукт окрашен в малиново-красный цвет. Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно.

Связанный с белками билирубин реагирует с диазосмесью после диссоциации белкового комплекса, которая достигается прибавлением к сыворотке кофеинового реактива.

Ход определения. Готовят две пробирки (контрольную и опытную). Составляют реакционную смесь по схеме:

Диазосмесь готовят (в количестве, достаточном для всей учебной группы), смешивая 10 мл 0,5%-ного раствора сульфаниловой кислоты и 0,3 мл 0,5%-ного раствора нитрата натрия.

Содержимое опытной и контрольной проб хорошо перешивают, ставят на 20 минут в темноту, затем колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 500-560 нм) против контроля.

Если в пробах развивается слабая окраска, то перед колориметрированием в обе пробирки добавляют по 3 капли 30%-ного раствора NaOH. При этом цвет раствора переходит в зеленый, а при большей концентрации билирубина в синий, часто наблюдается исчезновение мути. Пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром. Расчет производят по калибровочному графику.

Калибровочный график для определения концентрации общего билирубина.

Оформление работы. В протокол вносят принцип метода, результаты колориметрии и расчет. Отмечают пределы колебаний концентрации билирубина в норме.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8703 — | 8256 — или читать все.

источник

Билирубин и его фракции

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции

Принцип

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

Клинико‑диагностическое значение

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

источник

Методы определения билирубина и его метаболитов

Определение билирубина в сыворотке крови

В клинической практике используются различные методы определения билирубина и его фракций в сыворотке крови.

Наиболее распространенным из них является биохимический метод Ендрассика-Грофа. Он основан на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. При этом связанный конъюгированный билирубин (билирубин-глюкуронид) дает быструю («прямую») реакцию с диазореактивом,тогда как реакция непрямого свободного (не связанного с глюкуронидом) билирубина протекает значтельно медленнее. Для ее ускорения применяют различные вещества–акселераторы, например кофеин (метод Ендрассика-Клеггорна-Грофа), которые освобождают билирубин из белковых комплексов («непрямая» реакция). В результате взаимодействия с диазотированной сульфаниловой кислотой билирубин образует окрашенные соединения. Измерения проводят на фотометре.

Нормальная концентрация в крови:

общий билирубин — 8,5-20,5 мкМ/л,
связанный (прямой) билирубин — 0,9-4,3 мкМ/л,
свободный (непрямой) билирубин — 6,4-17,1 мкМ/л,
в моче у здоровых людей не определяется,

Уробилиноген в моче — 0,08-4,23 мкМ/сутки,
Стеркобилиноген в кале — 50-300 мл/сутки.

Рефферентные значения нормальных показателей общего, непрямого и прямого билирубина для взрослых, и детей приведены в таблице:

Таблица 2. Дифференциально-диагностические критерии желтух

Минеральный обмен

• Общие понятия. Функции минеральных веществ

• Промежуточный и конечный обмен минеральных веществ

• Характеристика отдельных элементов

• Обмен воды и электролитов

Минеральный обмен – совокупность процессов всасывания, распределения, усвоения и выделения минеральных веществ, находящихся в организме преимущественно в виде неорганических соединений.

Всего в организме обнаруживается свыше 70 элементов таблицы Д.И. Менделеева, 47 из них присутствуют постоянно и называются биогенными. Минеральные вещества играют важную роль в поддержании кислотно-основного равновесия, осмотического давления, системе свертывания крови, регуляции многочисленных ферментных систем и пр., т.е. имеют решающее значение в создании и поддержании гомеостаза.

По количественному содержанию в организме они делятся на макроэлементы, если их больше чем 0,01 % от массы тела (К, Са, Мg, Na, P, Cl) и микроэлементы (Mn, Zn, Cr, Cu, Fe, Co, Al, Se). Основную часть минеральных веществ организма составляют хлористые, фосфорнокислые и углекислые соли натрия, кальция, калия, магния. Соли в жидкостях организма находятся в частично или полностью диссоциированном виде, поэтому минеральные вещества присутствуют в виде ионов – катионов и анионов.

В результате биохимического исследования крови можно установить содержание магния (0,8-1,2ммоль/л), железа (9,0-31,3 мкмоль/л), натрия (135-145 ммоль/л), калия (3,5-5,0 ммоль/л), кальция (2,23-2,57 ммоль/л), фосфора (0,8-1,45 ммоль/л), хлора (95-105 ммоль/л).

Функции минеральных веществ:

1) пластическая (кальций, фосфор, магний);

2) поддержание осмотического давления (калий, натрий, хлор);

3) поддержание буферности биологических жидкостей (фосфор, калий, натрий);

4) поддержание коллоидных свойств тканей (все элементы);

5) детоксикационная (железо в составе цитохрома Р-450, сера в составе глутатиона);

6) проведение нервного импульса (натрий, калий);

7) участие в ферментативном катализе в качестве кофактора или ингибитора;

8) участие в гормональной регуляции (йод, цинк и кобальт входят в состав гормонов).

источник

Билирубин общий

Билирубин общий – это сумма промежуточных продуктов метаболизма гемоглобина, содержащихся в сыворотке крови: непрямого и прямого билирубина.

Общий билирубин крови, общий билирубин сыворотки.

Синонимы английские

Колориметрический фотометрический метод.

Мкмоль/л (микромоль на литр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную, капиллярную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

1. Не принимать пищу в течение 12 часов перед исследованием.
2. Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение в течение 30 минут до исследования.
3. Не курить за 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Данный тест предназначен для количественного определения содержания общего (прямого + непрямого) билирубина в сыворотке крови.

Билирубин – это продукт распада гемоглобина. Он имеет интенсивный желто-коричневый цвет. В связи с этим сам билирубин и продукты его метаболизма придают желчи, калу и моче соответствующую окраску.

Гемоглобин – основная часть эритроцитов (красных клеток крови). Его функция состоит в доставке кислорода в ткани из органов дыхания и обратном транспорте углекислого газа. Необходимость в расщеплении гемоглобина и удалении продуктов его распада возникает в связи с процессом постоянного обновления эритроцитов в крови. Красные клетки крови имеют ограниченную продолжительность жизни, которая составляет в среднем 90-150 дней. Эритроциты со сниженной жизнеспособностью распознаются клетками ретикулоэндотелиальной системы, поглощаются ими и распадаются на ферменты. Ретикулоэндотелиальная система представляет собой особые ткани, находящиеся в различных отделах организма и выполняющих иммунную функцию. Органами их особой концентрации являются селезенка, лимфатические узлы и костный мозг. В результате расщепления гемоглобина образуется непрямой (несвязанный) билирубин, который затем выделяется в циркулирующую кровь. За сутки у человека распадается около 1 % циркулирующих эритроцитов с образованием 100-250 мг билирубина.

Следующий этап трансформации билирубина происходит в печени. Клетки печени «захватывают» его из крови, связывают с другим метаболическим компонентом (глюкуроновой кислотой) и превращают в прямой, или связанный, билирубин. Присоединенная глюкуроновая кислота придает билирубину свойство растворяться в жидкости, что и позволяет ему растворяться в желчи, после чего в ее составе он сначала выводится в кишечник, а затем удаляется оттуда вместе с калом.

В крови должно находиться только небольшое количество непрямого билирубина, что соответствует нормальному процессу транспортировки этого вещества из мест его образования (ретикуло-эндотелиальной системы) в печень. Однако на некоторых этапах метаболизма билирубина могут происходить нарушения обмена, при которых его концентрация в сыворотке увеличивается. Это называется гипербилирубинемией (превышение уровня билирубина в крови). Если билирубина в крови слишком много, он может проникнуть из кровяного русла в окружающие ткани, что приведет к симптомам желтухи: желтому оттенку кожи, склер и видимых слизистых оболочек.

Выделяют три основных типа нарушений обмена билирубина в организме, приводящих к его накоплению в крови.

1. Усиление гемолиза эритроцитов. Это происходит при заболеваниях, когда разрушаются относительно молодые красные клетки крови, причем доля эритроцитов, подвергающихся гемолизу, возрастает. К таким отклонениям относятся некоторые заболевания крови, при которых происходит образование не вполне жизнеспособных эритроцитов (серповидно-клеточная анемия, сфероцитоз, сидеробластная анемия, пернициозная анемия), иммунная агрессия в отношении нормальных эритроцитов (гемолитическая болезнь новорождённых) и др. Кроме того, гемолиз эритроцитов может усиливаться в результате токсического действия на клетки крови некоторых химических веществ. Повышенный распад эритроцитов, в свою очередь, приводит к необходимости ферментативного расщепления большего количества гемоглобина в клетках ретикулоэндотелиальной системы. При этом образуется дополнительный объем непрямого билирубина, который впоследствии выделяется в кровоток. В итоге уровень билирубина повышен.
2. Нарушение функциональной и/или анатомической целостности печеночных клеток. К нему приводят заболевания, при которых поражаются клетки печени, наиболее распространены вирусные гепатиты. Кроме того, это может происходить при острых и хронических воздействиях токсических веществ: алкоголя, лекарственных средств, химикатов, применяемых в быту и промышленном производстве. Такие нарушения влекут за собой повышение проницаемости внешней оболочки печеночных клеток или полное ее разрушение. В результате содержимое печеночных клеток выходит в системный кровоток. Так как они всегда содержат большое количество билирубина, он тоже попадает в циркулирующую кровь, что приводит к гипербилирубинемии.
3. Препятствие для свободного прохождения желчи по желчевыводящим путям до ее попадания в кишечник. Это происходит из-за того, что желчные пути сдавливаются при деформации тканей, которые находятся в непосредственной близости к ним (опухоли, увеличенные лимфоузлы, рубцовые изменения), или из-за замедления двигательной активности желчных путей (дискинезия). Такие нарушения могут приводить к повышению давления желчи внутри желчных капилляров, их перерастяжению (вплоть до микроразрывов) и чрезмерной проницаемости стенок желчевыводящих путей, что сопровождается проникновением компонентов желчи в кровь и приводит к повышению уровня билирубина.

Кроме того, существует еще несколько других, не основных, причин повышенного содержания билирубина – это довольно редкие заболевания различного происхождения, но их клиническое значение невелико.

Таким образом, анализ на общий билирубин в сыворотке крови позволяет диагностировать различные заболевания, прямо или косвенно связанные с нарушением процессов кроветворения, функции печени и желчевыводящих путей.

Для чего используется исследование?

• Для диагностики различных заболеваний крови, при которых происходит усиленное разрушение эритроцитов: серповидно-клеточной анемии, сфероцитоза, сидеробластной/пернициозной анемии.
• Чтобы оценить состояние печени (целостность ее клеточных элементов).
• Чтобы выявить гепатит и степень его тяжести.
• Чтобы убедиться в нормальной проходимости желчных путей.
• Для диагностики физиологической и гемолитической желтухи новорождённых.
• Для диагностики некоторых заболеваний поджелудочной железы, а также других органов и тканей, связанных с желчевыводящими путями.
• Чтобы оценить тяжесть состояния больного при отравлении веществами, которые вызывают гемолиз эритроцитов.

Когда назначается исследование?

• При симптомах заболеваний крови.
• Когда необходимо оценить функциональное состояние печени.
• При желтухе, в частности у новорождённых.
• При диагностике заболеваний печени.
• При оценке функции желчных путей.
• При подозрении на вирусный гепатит.
• Когда проводится клиническое наблюдение за пациентом с заболеванием печени.
• При симптомах закупорки желчных путей.
• При наблюдении за состоянием пациента, отравившегося определенными химическими веществами.

Референсные значения (норма билирубина у новорождённых и пациентов других возрастных групп):

источник