Определение билирубина в сыворотке крови реактив

Унифицированный метод определения билирубина по диазореакции (метод Ендрассика-Грофа)

Принцип метода: Под воздействием НСI разрывается связь билирубина и образуется два дипиррола, которые диазотируются диазобензо сульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 125 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до 50-60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят водой до 100 мл.

5. Натрия хлорид: 154 ммоль/л (изотонический раствор: 0,9 г хлорида натрия в 100 мл воды.

8. Диазосмесь. Диазореактив 1: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300-400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСI, раствор доливают до 1 л. Диазореактив 2: натрия нитрит 5г/л: 0,5 г нитрита натрия в 100 мл воды. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива 1 и 0,3 мл диазореактива 2.

9. Билирубин для построения калибровочного графика 800 мг/л.

10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного Na₂СО₃ растворяют и доводят до 1 л водой.

11. Уксусная кислота, 4 моль/л; 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл водой.

Ход определения: В три пробирки: две опытные и одну холостую вносят реактивы: по 0,5 мл сыворотки крови, кофеиновый реактив вносят в первую опытную пробирку для определения общего билирубина и в холостую пробу по 1,75 мл, во вторую опытную не вносят. Затем во вторую опытную (это определение связанного билирубина) прибавляют 1,75 мл и в холостую пробу 0,25 мл раствора хлорида натрия. Вносят диазосмесь в первую и во вторую опытные пробирки по 0,25 мл.

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5-10 минут после добавления диазосмеси, при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 минут, после чего измеряют на ФЭК при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику.

Основной раствор билирубина: в колбе на 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30-35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na₂СО₃ и несколько раз перемешивают, доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором карбоната натрия.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. Этот раствор содержит на 100 мг/л билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для ее приготовления смешивают 13,9 мл той же сыворотки, 2мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 минут.

Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным: в 5 пробирок прибавляют 0,05 мл; 0,1 мл; 0,15 мл; 0,2 мл; 0,25 мл рабочего раствора билирубина, добавляют с первой по пятую: 0,45 мл; 0,4 мл; 0,35 мл; 0,3 мл; 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия. В пробах количество билирубина соответствует с первой по пятую пробирки: 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025 мг. Концентрация билирубина в сыворотке крови: 17,1 мкмоль/л; 34,2 мкмоль/л; 51,3 мкмоль/л; 68,4 мкмоль/л; 85,5 мкмоль/л.

Нормальные величины. В сыворотке крови содержится 8,5-20,5 мкмоль/л общего билирубина, из которого 75% приходится на долю свободного билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8703 — | 8256 — или читать все.

источник

Определение общего билирубина в сыворотке крови

(метод Иендрашика и Клеггорна)

Принцип метода. Билирубин образуется в организме в результате естественного распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень,селезенка). Билирубин относится к группе желчных пигментов и является токсическим веществом; он обезвреживается в клетках печени. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком. В печени происходит процесс обезвреживания по схеме:

билирубин + УДФ-глюкуроновая кислота билирубин (моно- и диглюкуроид)

Глюкурониды билирубина хорошо растворимы, они выводятся из печени по желчевыводящим путям.

В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый (диглюкуронид ). Вместе обе формы составляют общий билирубин.

Определение содержания билирубина в крови является важным диагностическим тестом. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах-0,5-1,2 мг/дл, причем 75% из них составляет билирубин, связанный с белками (нерастворимый).

При различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия, концентрация билирубина повышается до 30-35 мг/дл.

Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окраски продукта взаимодействия билирубина с диазореактивом. Этот продукт окрашен в малиново-красный цвет. Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно.

Связанный с белками билирубин реагирует с диазосмесью после диссоциации белкового комплекса, которая достигается прибавлением к сыворотке кофеинового реактива.

Ход определения. Готовят две пробирки (контрольную и опытную). Составляют реакционную смесь по схеме:

Диазосмесь готовят (в количестве, достаточном для всей учебной группы), смешивая 10 мл 0,5%-ного раствора сульфаниловой кислоты и 0,3 мл 0,5%-ного раствора нитрата натрия.

Содержимое опытной и контрольной проб хорошо перешивают, ставят на 20 минут в темноту, затем колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 500-560 нм) против контроля.

Если в пробах развивается слабая окраска, то перед колориметрированием в обе пробирки добавляют по 3 капли 30%-ного раствора NaOH. При этом цвет раствора переходит в зеленый, а при большей концентрации билирубина в синий, часто наблюдается исчезновение мути. Пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром. Расчет производят по калибровочному графику.

Калибровочный график для определения концентрации общего билирубина.

Оформление работы. В протокол вносят принцип метода, результаты колориметрии и расчет. Отмечают пределы колебаний концентрации билирубина в норме.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Увлечёшься девушкой-вырастут хвосты, займёшься учебой-вырастут рога 10192 — | 7904 — или читать все.

источник

Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа).

Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный — после добавления кофеинового реактива.
Реактивы: кофеиновый реактив. 5 г чистого кофеина, 7,5 г натрия бензоата, 12,5 г натрия ацетата растворяют в 90 мл дистиллированной воды, нагревают до 50—60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят дистиллированной водой до 100 мл. Срок хранения 2 нед;
натрия хлорид (ч. д. а. или х. ч.), 154 моль/л. 0,9 г натрия хлорида помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят водой до метки. НС1 концентрированная (ч. д. а., х. ч.); сульфаниловая кислота (ч. д. а.);
диазореактив I. 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 мл дистиллированной воды, прибавляют 15 мл концентрированной НС1 (плотность 1,19 кг/м3). Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после полного растворения сульфаниловой кислоты и охлаждения раствор доливают дистиллированной водой до 1 л. Реактив стойкий, хранят в посуде из темного стекла;
диазореактив II. Натрия нитрит (№N02, ч. д. а., х. ч.), 5 г/л (0,07 моль/л). 0,5 г натрия нитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Реактив стабилен в течение 2 нед при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II;
билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать наборы отечественных или зарубежных фирм, содержащие билирубин высокой степени чистоты. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора;
натрия карбонат, 0,1 моль/л. 10,6 г безводного №гСОз растворяют и доводят до 1 л дистиллированной водой;
уксусная кислота, 4 моль/л. 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой.
Оборудование: фотоэлектроколориметр; колбы мерные.
Ход определения. ВЗ пробирки (для общего и связанного билирубина и для контроля) вносят реактивы, как указано в таблице 16.

1. Смеси реактивов для определения билирубина в сыворотке крови

Для определения связанного билирубина измерение на фотоэлектроколориметре проводят через 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин.

Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 мин, после чего измеряют на ФЭКе. В дальнейшем окраска не изменяется.
Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при колориметрировании общего и связанного билирубина, вычитают показатель контроля.
Расчет ведут по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина. Для определения уровня непрямого билирубина вычитают из показателя общего его содержания показатель прямого билирубина.
Способ 1. Калибровочный график строят по способу Шелон- га—Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови.
Реактивы для построения калибровочного графика. 1. Основной раствор билирубина. Препараты кристаллического билирубина отличаются по своим свойствам. Не каждый билирубин может быть использован для построения калибровочного графика. Допустим лишь тот билирубин, 1 мг%-ный раствор которого при растворении в хлороформе (для наркоза) при 25 °С дает на спектрофотометре абсорбцию от 1,01 до 1,07 при длине волны 453 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
В колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина (имеющийся в продаже билирубин является непрямореагирую- щим) в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия (10,6 г безводного Иа2СОз доводят до 1 л дистиллированной водой) и хорошо перемешивают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором ИагСОз и несколько раз перемеши

вают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем билирубин окисляется.

1. Рабочий раствор билирубина. К 13,9 мл свежей негемолизи- рованной сыворотки крови добавляют 2 мл свежеприготовленного раствора билирубина и 0,1 мл (4 моль/л) раствора уксусной кислоты (25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой). Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней. Он содержит на 10 мг% билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке крови, при измерении на ФЭКе из величины экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для приготовления компенсационной жидкости смешивают

1. мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мг 0,1 моль/л раствора ИагСОз и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина (табл. 17).
17. Разведения билирубина для построения калибровочного графика

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора натрия гидроксида. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин. Из компенсационной жидкости готовят разведения аналогично калибровочным (см. табл. 17) и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.
Способ 2. Калибровочный график строят по готовым наборам реактивов, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами. Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.
Подбор реактивов в коммерческих наборах основан также на диазореакции, положенной в основу метода Ендрассика—Клеггор- на—Грофа.
Примечание. Сыворотка или плазма крови должны быть свежими, свободными от гемолиза, прозрачными. Плазму или сыворотку крови хранят не более двух дней при температуре 4—25 °С. Исследования проводят незамедлительно. Образцы крови защищают от света.
Источник: 43.

источник

Лабораторная диагностика. Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфониевая кислота, которая реагирует со связанным билирубином и дает красное окрашивание. По интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он также вызывает красное окрашиваниераствора. По интенсивности последнего определяют концентрацию общего билирубина. Свободный билирубин равен разнице между общим и связанным.

Ход определения. В три пробирки (для определения уровня общего билирубина, связанной фракции и постановки контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме (табл.2.).

Данные для определения уровня билирубина в сыворотке крови

Колориметрируют пробы при зеленом светофильтре (500-560 нм); применяют кювету с шириной слоя 5 мм. Оценку результатов проводят по калибровочному графику, построенному в соответствии с инструкцией к наборам реагентов «Билирубин – эталон» фирмы «Лахема».

Находят содержание общего и связанного билирубина в мкмоль/л. Для определения уровня свободной фракции из цифр общего билирубина вычитают показатель конъюгированного.

В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л. 75% его количества приходится на долю свободной фракции.

Средние величины содержания в плазме общего, конъюгированного и свободного билирубина составляют соответственно 11,12; 2,57 и 8,56 мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение исследования

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Для студента самое главное не сдать экзамен, а вовремя вспомнить про него. 10454 — | 7708 — или читать все.

источник

Определение билирубина в сыворотке крови реактив

В незначительном количестве билирубин может быть обнаружен в сыворотке крови у здоровой лошади. В значительных количествах билирубин появляется только при патологических процессах.

Билирубин образуется из гемоглобина распавшихся эритроцитов. В результате распада образуется два пигмента—гемосидерин, содержащий железо, и гематорфирин. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы из этих пигментов образуется билирубин, связанный с глобулинами. Этот билирубин некоторое время циркулирует в крови, окрашивая сыворотку в желтоватый цвет. Затем он захватывается купферовскими клетками печени и свобождается от белка, после чего становится полноценным билирубином, который поступает в кишечник. Часть пигмента в виде уробилина всасывается в кровь, а часть в виде стеркобилина выводится с фекалием.

При патологии возможно скопление чистого билирубина в крови и выведение его через почки с мочой. Следует отметить, что билирубин, связанный с белком, через здоровые почки не проходит, но его выделение возможно при нефритах.

Билирубин, связанный с белком, называется билирубином, не проведенным через печень. Повышенное количество такого билирубина в крови отмечается при гемолитических желтухах. Чем значительнее гемолиз эритроцитов, тем больше содержится в сыворотке крови билирубина, не проведенного через печень.

Билирубин, не связанный с глобулинами, называется проведенным через печень. Значительное количество такого билирубина в сыворотке крови можно обнаружить при различного рода препятствиях к оттоку желчи в кишечник. Желчь застаивается в выходящих путях и затем начинает поступать в кровь.

Определение билирубина в сыворотке крови является, следовательно, надежным методом дифференциации желтух.

Ван-ден-Берг, разработавший метод дифференциации желтух, различает два вида реакции на билирубин: прямую и непрямую.

Прямой реакцией называется такая, которая возникает после добавления рабочего реактива. Окрашивание жидкости может иметь вариации по времени и интенсивности окраски. Различают реакции прямую, быструю или моментальную, когда жидкость окрашивается сейчас же после добавления реактива; прямую двухфазную, если после добавления реактива жидкость окрашивается очень слабо, а затем окрашивание становится все более и более интенсивным, и прямую замедленную, когда окрашивание появляется спустя 10—15 минут. Прямая реакция получается при наличии в крови билирубина, проведенного через печень. Прямая, быстрая реакция отмечается при механической желтухе, возникающей при закупорке желчного протока камнями, паразитами.

Прямая двухфазная реакция бывает при желтухах смешанного характера, а прямая замедленная—при катаральное желтухе с нарушением функции печеночных клеток.

Непрямая реакция возникает после добавления спирта. Она выявляет билирубин, не проведенный через печень и связанный с глобулиновой фракцией. Спирт коагулирует белок и тем самым разрушает связь билирубина с глобулинами и создает нормальные условия для хода реакции.

Непрямая реакция указывает на гемолитическую желтуху, когда билирубина бывает больше 3 мг% в 100 мл сыворотки крови.

Для определения билирубина в сыворотке крови рекомендуется несколько методов. По точности результатов на первом месте стоит колориметрический метод Ван-ден-Берга. Он применяется чаще при выполнении научных работ, так как требует лабораторных условий, химически чистых реактивов и колориметра Аутенрита или Дюбоска. В клинической практике используются другие методы, например Бакальчука и Херцфельда. Для ориентировочных исследований может быть использован метод Мауленграхта в модификации Синева для животных.

Способ Ван-ден-Берга. Для постановки реакции необходимо иметь колориметр Аутенрита или Дюбоска, диазореактивы Эрлиха, 96%-ный спирт и стандартный раствор.

Рабочая смесь готовится из разных диазореактивов. Первый реактив— сульфаниловой кислоты 1,0, соляной кислоты 15 мл (уд. вес 1,125) и дистиллированной воды 1 литр. Второй—азотистокислого натрия 0,5 и дистиллированной воды 100 мл. Рабочий реактив готовится в соотношении 8 мл первого реактива и 0,25 мл второго.

Наилучшим и наиболее употребительным является кобальтовый стандарт. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2,161 г сернокислого кобальта, предварительно освобожденного от кристаллизационной воды путем нагревания. Можно также взять 3,92 г кристаллического CoS04*7H20. Этот раствор соответствует раствору билирубина 1:200 000 (0,5 мг%).

Раствором такой же окраски, но менее стойким, является раствор, полученный следующим образом: 1) в колбочке емкостью в 100 мл, растворяют 0,1508 железо-аммиачных квасцов в небольшом количестве воды, прибавляют затем 50 мл соляной кислоты (удельный вес 1,19) и доводят после этого водой уровень жидкости до метки 100. Из этого основного раствора, имеющего 1/320 нормальности, приготовляют рабочий реактив (1/8000). В колбу емкостью 250 мл вносят 10 мл основного раствора, смешивают с 25 мл соляной кислоты и доливают до 250 мл водой. Рабочий реактив годен для работы в течение нескольких месяцев; 2) 10%-ный раствор роданистого калия или аммония.

Приготовление стандартного раствора. К 3 мл рабочего реактива прибавляется в делительной воронке 3 мл 10%-ного раствора роданистого калия и 12 мл сернокислого эфира. При постоянном охлаждении делительной воронки под краном, жидкость смешивают до тех пор, пока роданистое железо не будет экстрагировано эфиром. Этим розовым эфирным раствором роданистого железа и пользуются для сравнения в качестве стандарта. Раствор нужно предохранять от испарения. По своей окраске стандарт соответствует 0,5 мг билирубина на 100 мл сыворотки крсви.

Техника исследования сводится к следующему: К 2 мл испытуемой сыворотки добавляют 4 мл спирта и смесь центрифугируют в течение 20 минут; 1 мл раствора переносят в клин колориметра Аутенрита или стаканчик колориметра Дюбоска и прибавляют 0,5 мл рабочего реактива.

Наполнив затем второй стаканчик колориметра кобальтовым стандартом или раствором роданистого железа, сравнивают окраску обоих растворов и устанавливают, на каких делениях шкалы получается идентичное окрашивание в обоих стаканчиках. Расчет производится по формуле:

C1—концентрация исследуемой жидкости;

С2—концентрация стандартного раствора;

Н1—высота столба исследуемой жидкости;

При расчетах необходимо учитывать степень разведения сыворотки.

При наличии билирубина получается розовое окрашивание, но нужно учесть что окрашивание зависит от реакции среды. В нейтральной среде окрашивание получается розовое, в слабокислой—эта окраска имеет слабосиневато-фиолетовый оттенок. Такая же окраска получается и при медленном проведении пробы.

Метод Бакальчука. Для постановки пробы используются диа-зореактивы (см. метод Ван-ден-Берга), из которых готовится рабочая смесь в пропорции: 10 мл реактива № 1 и 0,3 мл реактива № 2.

Для определения билирубина берется пять пробирок; в них наливают по 0,5 мл физиологического раствора, а затем в первую вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки. Перемешав жидкость, отсасывают при помощи пипетки 0,5 мл смеси и переносят ее во вторую пробирку. Из второй после перемешивания смеси переносят 0,5 мл в третью и т. д. Излишек в пятой пробирке отсасывается и выливается в чашку. В результате получается разведение кратное 2, 4, 8, 16, 32.

В каждую из пробирок вносят затем по 0,5 рабочего реактива и осторожно смешивают. При наличии билирубина получается розовое окрашивание. Концом реакции считается разведение, в котором едва различимо розовое окрашивание.

Если окрашивание не наступило в течение 15 минут, в пробирки добавляют спирт. Помутневшая вследствие осаждения белка жидкость при наличии билирубина окрашивается в розовато-малиновый цвет. Чтобы лучше заметить в мутной жидкости изменение цвета, рекомендуется добавить по 0,5 мл эфира и рассматривать на белом фоне. Разница между бесцветным слоем эфира и окрашенной испытуемой жидкостью выступает очень отчетливо. Умножив разведение на 0,016, устанавливают количество билирубина в 1 мл. Умножением на 100 получают количество билирубина в миллиграммах на 100 мл сыворотки.

Методом Бакальчука можно определить, кроме количества билирубина, разновидность его. Появление окрашивания после добавления рабочего реактива говорит в пользу билирубина, проведенного через печень (прямая реакция) изменение цвета после добавления спирта свидетельствует о наличии билирубина, не проведенного через печень (непрямая реакция).

Метод Херцфельда. В качестве реактива используется смесь 19 частей 25%-ной соляной кислоты и 1 часть 25%-ной азотной кислоты. Этот основной раствор отличается стойкостью и хорошо сохраняется в продолжение длительного времени.

Перед постановкой опыта каждый раз готовят рабочий реактив, состоящий из 1 части реактива и 4 частей 96° спирта.

Для определения билирубина берут шесть пробирок. В первую пробирку наливают 1 мл испытуемой сыворотки, а в остальные пять—по 0,5 мл физиологического раствора. Затем 0,5 мл сыворотки из первой пробирки переносят во вторую. Перемешав жидкость, отстаивают 0,5 мм смеси и переносят в третью и т. д. Излишек в 0,5 мл в последней пробирке отстаивается и удаляется, Приготовив таким образом ряд разведений, в каждую пробирку вносят по 0,5 мл рабочего реактива.

При наличии билирубина получается окрашивание жидкости в зеленый цвет, который постепенно теряет свою интенсивность по мере разведения сыворотки. Конечная реакция дает еле заметное зеленое окрашивание. Умножая степень разведения на 0,016, получают количество билирубина в 1 мл сыворотки.

Метод Синева. Стандарт Синева (двухромовокислый калий 0,1, серная кислота 3,0 и дистиллированная вода 200,0), соответствующий по своей окраске слабожелтому оттенку сыворотки лошади, принимается за единицу. Исследование производится в штативе. Рядом с пробиркой, содержащей стандарт, помещается пробирка с 0,5 мл испытуемой сыворотки. Затем при помощи градуированной пипетки в испытуемую сыворотку добавляют по 0,5 мл 30%-ного раствора поваренной соли до тех пор, пока окраска не будет соответствовать цвету стандарта. Количество билирубина определяется по формуле: 0,5 +Х=Количеству билирубиновых единиц. В нормальной сыворотке цвет соответствует стандарту и не требует разведения, а потому количество билирубина по этой формуле будет равняться 0,5+0,5=1,0.

Количество билирубина в сыворотке крови здоровой лошади (в мг на 100 мл), определенное колориметрическим методом, по данным отдельных авторов, колеблется в следующих пределах.

По Хрусталеву 0,37—3,0, среднее 1,09;
по Синеву 0,3 —1,0, среднее 0,8;

По Симонову 0,19—1,09, среднее — 0,64.

Содержание билирубина в сыворотке значительно повышается при инфлюэнце, крупозной и гриппозной пневмонии, мыте и некоторых других заболеваниях.

Наиболее высокие цифры отмечаются при кровепятнистой болезни, отравлении S02 и хвощом, когда количество билирубина повышается до 4 мг. Максимальные изменения обнаружены при энцефаломиэлите лошадей (8—12 мг на 100 мл сыворотки).

Значительные билирубинемии отмечаются при большом количестве заболеваний, имеющих совершенно различную клиническую картину, а потому могут быть с успехом использованы в дифференциации процессов и для прогноза.

источник