Определение фибриногена на полуавтоматическом коагулометре

Медицинский прибор предназначен для исследования гемостаза, с его помощью определяются четыре теста: фибриноген-тест (анализируется время образования сгустка фибрина во взятом у пациента биоматериале); тромбин-тест (нужно знать показатель при нарушении свертываемости крови, проведении лечения гепарином); АЧТВ-тест (важен для определения коагуляционных нарушений, контроля в ходе терапии гепарином); протромбин-тест (помогает контролировать результативность антикоагулянтного лечения).

В современной медицине коагулометры сменили визуальный анализ, который еще несколько десятилетий назад проводился с помощью секундомера и бани. Ручная диагностика не является точной на сто процентов, есть риск постановки неверного диагноза. Также повышается риск появления геморрагического кровотечения либо образования тромба.

Новые модели коагулометров позволяют получить точную информацию, поскольку в их основе лежат оптико-механические и механические методики детекции. Приборы бывают автоматические и полуавтоматические. Автоматическое оборудование – это оптимальный вариант для использования в медицинских учреждениях, в которых ежедневно принимается большое количество пациентов. С помощью автоматических анализаторов гемостаза можно провести диагностику за короткий промежуток времени. Плюс ко всему данные приспособления имеют большую мощность (производительность), по сравнению с полуавтоматом.

Полуавтоматические устройства нужны для проведения диагностики клоттинговой методикой: образуется фибрин либо целый сгусток крови. Для проведения исследования с использованием полуавтоматического коагулометра понадобится всего лишь от 50 до 200 мкл. В маленьких и средних лабораториях, передвижных центрах диагностики ставятся полуавтоматические коагулометры.

Анализаторы гемостаза применяются для проведения диагностики в различных сферах, в частности, в медицине. В гематологии устройство используется с целью выявления патологических изменений, касающихся гемостаза, и нарушений противосвертывающей системы. В кардиологии коагулометр нужен для обследования свертываемости крови больного во время терапии болезней сердца.

В гепатологии аппарат помогает при лечении гепатита и цирроза печени. Анализатор гемостаза необходим для корректировки терапии людей, которые принимают антикоагулянты. В хирургии оборудование используется с целью контроля употребления «Варфарина» и трансфузионного лечения.

В роддомах коагулометр является одним из важнейших аппаратов, поскольку с его помощью врач может проконтролировать уровень гемостаза у женщин, которые вынашивают ребенка, и рожениц. Устройство применяется для проведения экспресс-теста, показывающего нарушения гемостаза.

Анализ на свертываемость крови, который проводится с помощью коагулометра, необходим перед хирургическим вмешательством, а также для определения патологических изменений в организме. Исследование позволяет оценить вероятность кровоизлияний и образований тромбов во время операции.

Показаниями к проведению анализа есть:

• нарушение работы печени;
• травмы, которые сопровождаются внешними и внутренними кровотечениями;
• выкидыш;
• ишемия сердца, предынфарктное состояние и инфаркт;
• склонность к образованию тромбов, тромбоз;
• длительное лечение определенными лекарственными средствами.

При геморрагических патологических изменениях, хронической анемии, кровотечениях из носовой полости, обильных месячных, новообразованиях в урине и кале, необходимо сделать анализ на свертываемость крови.

Во время планового медицинского осмотра доктор нередко может отправить пациентов на сдачу данного анализа.

К диагностике следует предварительно подготовиться: перед манипуляцией нельзя принимать пищу и пить не меньше, чем за 10-12 часов. За 2-3 дня до сдачи крови не рекомендуется употреблять жирную, острую и консервированную еду. Можно пить только чистую воду. Чай, кофе, сок, компот, спиртные напитки также запрещены.

За полчаса до манипуляции нельзя нервничать, переживать, физически себя нагружать и курить. Если пациент несколько дней назад употреблял препараты-антикоагулянты, следует предупредить об этом лечащего врача. Важным является дозировка и длительность курса терапии. Если в ходе забора биоматериала человека начинает тошнить, кружится голова, ухудшается самочувствие, следует незамедлительно сказать медицинскому работнику об этих проявлениях.

Анализ с помощью коагулометра проводится достаточно просто: для получения достоверных результатов медсестра или медбрат делает забор венозной или капиллярной крови. Объем биоматериала колеблется от 25 мкл до 200 мкл. Штатным объемом крови для исследования считается 50 мкл. Полученный образец помещается в аппарат и через небольшой промежуток времени на мониторе высвечиваются результаты (4 главных показателя и дополнительные). Итоговая информация сравнивается с общепринятыми нормами.

Оценка результатов исследования должна проводиться по нормативам конкретного диагностического центра или лаборатории. Нормальным считается протромбиновое время 11-15 секунд. Показатель МНО должен варьироваться от 0,82 до 1,18 измерительных единиц. Протромбиновый индекс в норме составляет 72-123%. Тромбиновое время должно быть в пределах 14-21 секунд, 76-126% – это норма для антитромбина.

Норма фибриногена составляет 2,7-4 грамма. В пределах 0,36-0,48 измерительных единиц растворяются фибрин-мономерные комплексы, а от 250 до 550 нг/мл должен находиться показатель D-диаметра.

Показатель скорости свертываемости крови позволяет не только оценить быстроту формирования фибрина, но и время между началом и окончанием кровотечения. При исследовании биопробы, взятой из вены, скорость образования тромба должна быть в пределах 5-10 минут.

Если показатель выше нормы, это говорит о возможной гемофилии, дефиците витамина С, патологических изменениях в печени, тромбоцитопении. Повышение гемолиза может возникнуть из-за лечения медикаментами, такими как «Аспирин», «Варфарин» и «Трентал».

Если кровь свертывается за 3-4 минуты, это говорит об ускоренном формировании сгустков или обширном кровотечении. Отклонение от нормы в сторону уменьшения нередко бывает у женщин из-за употребления противозачаточных лекарственных средств.

Другие параметры во время исследования показывают возникновение ряда заболеваний и нарушений в организме. Например, отклонение от нормы показателя АЧТВ может свидетельствовать об аутоиммунных болезнях, патологии печени, ДВС-синдроме.

При выборе прибора нужно учитывать численность параметров, которые он определяет. Новые модели анализаторов гемостаза выполняют больше чем 16 тестов. Существует три метода диагностики и регистрации сгустка: первый – оптико-механический (оптические и механические методы); второй – оптический; третий – механический. Медики считают наиболее результативной первую методику.

Чтобы коагулометр исправно работал, нужно знать о его мощности. По производительности аппараты бывают:

• одноканальный (делают до десяти проб в сутки);
• двухканальный (от 10 до 20 проб в сутки);
• четырехканальный (до сорока тестов в сутки).

Всемирная организация здравоохранения рекомендует медицинским учреждениям покупать коагулометры с двумя и четырьмя каналами для избегания ошибок во время исследования.

Анализаторы гемостаза работают с маленькими объемами биоматериала, поэтому устройства используются в скрининге и педиатрии. Небольшое количество расходованных биопроб позволяет провести тест при необходимости от 1 до 3 раз. Данные, полученные прибором, можно распечатать с помощью принтера.

При покупке коагулометра в лабораторию, следует обратить внимание на численность каналов, количество отделений для биоматериала и реагентов. В современных приспособлениях есть возможность передачи информации в лабораторную информационную сеть (ЛИС).

К плюсам анализатора гемостаза можно отнести: стопроцентную достоверность полученных результатов анализа; минимальное количество расходных биологических материалов; минимум затрат на лекарственные средства; удобный вывод результатов на дисплей; возможность распечатывать полученные данные и отправлять в ЛИС.

Использование устройства позволяет исключить вероятность ошибки лаборанта (человеческий фактор). Аппарат включается и выключается автоматически, поэтому в диагностике специалист принимает самое минимальное участие. Прибор легкий в эксплуатации и обслуживании. С помощью оборудования можно провести хромогенный и клоттинговый анализы.

В аппарате встроенный специальный сканер, с помощью которого считывается штрих-код и автоматически идентифицируется биообразец пациента. В современных моделях коагулометров есть мониторинг температурных режимов проб и реагентов.

Также, для упрощения работы лаборанта, на мониторе высвечивается инструкция по использованию, позволяющая проводить исследования без ошибок и сразу же получать точные результаты.

Учет вида основного заболевания и клинической ситуации, на фоне которой возникли нарушения гемостаза, анализ основных клинических проявлений этих нарушений и возможных этиологических и патогенетических факторов их развития часто позволяют определить преобладающий у конкретного больного вид патологии системы гемостаза, наметить план дальнейшего обследования и лечения.

Вместе с тем разнообразие сдвигов в системе гемостаза у онкогематологических больных, возможность наслоения одних нарушений на другие, трансформации их друг в друга — все это требует достаточно развернутого динамического исследования разных параметров клеточного состава крови, гемореологии, тромбоцитарно-сосудистого и коагуляционного гемостаза.

При таких исследованиях в первую очередь надо учитывать соотношение в исследуемой крови объемов клеток и плазмы, т. е. гематокрит. Это очень важно для правильной стабилизации крови цитратом. Традиционно принятое соотношение кровь/ цитрат 9:1, приемлемо только при нормальном показателе гематокрита (40—45 %).

При подготовке к исследованию крови и плазмы больных слудует учитывать, что показатель гематокрита у них может быть резко снижен (при всех видах анемизации) или значительно повышен (при полицитемии). В первом случае необходимо повысить дозу добавляемого натрия цитрата с учетом увеличенного объема плазмы, а во втором — значительно уменьшить его количество.

В случае значительной анемизации вследствие недостаточной дозы добавленного натрия цитрата может выявиться «наведенная» (ложная) гиперкоагуляция (вплоть до спонтанного микросвертывания крови перед началом исследования), а во втором — ложная гипокоагуляция, связанная с действием избыточной дозы натрия цитрата при малом относительном содержании плазмы в крови больного.
Известно, что именно эта техническая ошибка стала источником долго существовавших ложных представлений о том, что при истинной полицитемии имеется якобы «компенсаторная» гипокоагуляция.

Повышение гематокритного показателя, как известно, само по себе является признаком тромбофилии. Оценка содержания тромбоцитов в крови и их адгезивно-агрегационной функции (если это позволяет достаточное их количество в крови), а также определение числа и исследование морфологии мегакариоцитов в препаратах костного мозга — второй важный этап расшифровки природы нарушений гемостаза при гемобластозах.

При тромбоцитопении следует на основании оценки клинической ситуации и результатов других тестов определить ведущий механизм ее возникновения: преимущественно гипо-продукционная форма, форма потребления, связанная с ДВС-синдромом, или форма депонирования. В случае гипертромбоцитоза важно оценить степень его выраженности, учитывая, что при увеличении содержания тромбоцитов в крови до 1000,0—1200,0*109/л преобладают тромботические явления, а при более высоком их количестве — тяжелая «парадоксальная» кровоточивость.

Частым и тяжелым нарушением гемостаза у онкогематологических больных является ДВС-синдром. Он может быть «неопластическим», т. е. связанным с самим лейкемическим процессом, вторичным «инфекционно-септическим», обусловленным соответствующими бактериальными или вирусными осложнениями, либо смешанного генеза, когда имеются признаки как первого, так и второго варианта. Разграничению этих форм способствуют тщательный анализ клинической картины заболевания, включающий выявление признаков инфекционного процесса (от некротического тонзиллита и стоматита до пневмоний и септической лихорадки) и бактериемии (с помощью современных экспресс-методик — бакталлерт и др.), а также выраженность ряда лабораторных признаков самого ДВС-синдрома.

К последним, помимо сдвигов общих параметров коагулограммы (активированное парциальное тромбопластиновое время—АПТВ, протромбиновый показатель, тромбиновое время свертывания и уровень фибриногена в плазме) относятся следующие признаки тромбинемии и активации фибринолиза: 1) повышение содержания в плазме растворимых фибринмономерных комплексов (РФМК). Определяют оптимально с помощью фенантролинового теста; 2) повышение содержания в плазме фибрин-мономеров. Выявляют при постановке тестов их преципитации на эритроцитах или частицах латекса; 3) другие признаки трансформации протромбина в тромбин и наличия тромбинемии (повышение содержания в плазме фрагментов 1 + 2 протромбина, уровня фибринопептида А и антигена комплексов тромбин-антитромбин III). Для установления диагноза обычно достаточно выполнения не всех этих тестов, а по одному из каждой группы.

Особо следует остановиться на определении фибриногена в плазме (лучше на коагулометре по Клауссу). При острых неопластических ДВС-синдромах уровень этого белка в плазме, как правило, снижается (в особо тяжелых случаях почти до нуля), тогда как при инфекционно-септических он повышен или близок к нормальному. Это часто помогает дифференцировать указанные варианты ДВС-синдрома.

Большое значение при диагностике нарушений гемостаза имеет определение содержания в плазме конечных продуктов расщепления плазмином фибриногена (фрагменты D) и фибрина (димер D-D), что дает представление соответственно об интенсивности процессов фибриногенолиза и фибринолиза. Высокий уровень димера D-D свидетельствует как о массивном внутрисосудистом свертывании крови, так и о высоком фибринолизе. Это характерно для ДВС-синдрома, тромбирования магистральных вен и(или) тромбоэмболии легочной артерии.

Значительный фибриногенолиз (повышение уровня фрагмента D) характерен как для массивной общей активации плазминовой системы, и в этом случае он сочетается с повышенным уровнем димера D-D, так и для преобладания расщепления несвернувшегося фибриногена. Оба эти варианта часто наблюдаются при ОПЛ и ОМЛ.

Отличительным признаком ДВС-синдрома является депрессия содержания в плазме физиологических антикоагулянтов: антитромбина III, белка С и др., что определяется с помощью функциональных (в том числе с помощью хромогенных субстратов) и иммуноферментных методик. Эти исследования имеют также дифференциально-диагностическое значение, поскольку облегчают разграничение синдромов ДВС и ТТП. Для последнего характерны также высокая мультимерность фактора Виллебранда, определяемая методом электрофереза, и во многих случаях снижение содержания в плазме активности металлопротеиназы ADAMATS-13. При ДВС-синдроме эти нарушения не выявляются.

Предлагаемые в настоящее время к использованию в клинической лабораторной практике коагулометры относятся к приборам двух типов: механическому и оптическому, в основе деления лежит механизм, предназначенный для регистрации времени образования сгустка фибрина в тестируемой смеси. По точности и воспроизводимости регистрации времени свертывания в бедной тромбоцитами плазме оптические и механические коагулометры не отличаются друг от друга и значимо превосходят мануальные варианты исследования системы гемостаза. При оптической регистрации образование сгустка фиксируется в ответ на изменение оптических свойств тестируемой смеси. При механическом типе регистрирующее устройство фиксирует изменение скорости перемешивания тестируемой смеси (вследствие изменения вязкости тестируемой смеси) шариком или каким‑либо другим устройством для перемешивания. Большинство механических коагулометров – шариковые. Неоспоримым преимуществом механических коагу‑лометров является возможность регистрации коагуляции цельной крови, что остается актуальным в педиатрической практике и при скрининговом обследовании. Однако при регистрации времени свертывания в крови ряда больных точность такого исследования несколько ниже, чем при определении времени свертывания в плазме, так как оказывает влияние показатель гематокрита (время свертывания у больного с плеторическим синдромом будет отличаться от времени свертывания у больного с анемией). Весьма удобно, что почти на всех коагулометрах с оптическим типом регистрации старт времени коагуляции происходит автоматически в ответ на изменение оптической плотности после добавления стартового реагента (например, стартовым реагентом в тест‑системе АПТВ является хлорид кальция, т. е. последний, добавляемый в тестируемую смесь реагент).

К совмещенным устройствам следует отнести редкие экземпляры коагулометров, в которых предусмотрена возможность выбора оптического или механического типа регистрации (т. е. в одном приборе совмещены оптический и механический принципы регистрации). К совмещенным следует отнести отечественный Ми‑нилаб‑701.

Различают одноканальные, двухканальные, четырехканаль‑ные и многоканальные коагулометры. Как правило, число каналов не бывает более десяти. Производительность одноканального коагулометра низка. Опытный лаборант, используя мануальную технику, выполнит большинство коагуляционных тестов в 2–3 раза быстрее, чем на одноканальном коагулометре. У коагуло‑метров, имеющих более двух регистрирующих каналов, число каналов, как правило, кратное, так как большинство производителей предусматривают возможность дублирующих определений и вычисление коэффициента вариации между двумя каналами.

Число каналов автоматического коагулометра для его производительности не имеет существенного значения, поскольку производительность автоматического коагулометра, как правило, выше многоканальных.

В представленной таблице показано оптимальное число регистрирующих каналов коагулометра без автоматических функций в зависимости от числа коагуляционных тестов, выполняемых в течение рабочего дня в клинико‑диагностической лаборатории (см. табл. 4).

Таблица 4 Виды коагуляторов

Некоторые коагулометры совмещены с фотометрами для выполнения амидолитических и/или иммунологических тестов. Такие коагулометры называют комбинированными. Большинство же коагулометров не способны выполнять амидолитические и/или иммунологические тесты.

Автоматическим коагулометром следует называть коагуло‑метр с высокой производительностью, в котором предусмотрена программа, полностью контролирующая добавление реагентов (и позволяющая изменять объемы дозируемых реагентов), а также автоматическую подачу образцов плазмы для исследования, наличие программируемого алгоритма, позволяющего выполнять разные тесты для разных образцов плазмы, автоматическую регистрацию и запоминание результатов исследования, с возможностью последующей обработки этих результатов.

Полуавтоматическими следует называть коагулометры, имеющие программируемый модуль, позволяющий автоматически добавлять реагенты в кювету для регистрации коагуляции (но не позволяющий добавлять исследуемую плазму в кювету). Кроме того, такие коагулометры имеют автоматическую регистрацию и запоминание результатов исследования, с возможностью обработки результатов.

Коагулометры без автоматических функций с программируемым модулем вычислений – это наиболее распространенный вариант. Такой коагулометр имеет программируемый модуль для выполнения вычислений и возможность хранения в памяти коагу‑лометра калибровочных кривых (что весьма значимо для определения уровня фибриногена).

Коагулятором следует назвать примитивный коагулометр, позволяющий определить только время свертывания. Коагулятор не имеет программируемого модуля для выполнения вычислений, поэтому не предусмотрена возможность хранения какой‑либо информации, в том числе нет возможности хранения калибровочных кривых, нет модуля распечатки результатов, нет возможности какого‑либо расчета, поэтому коагуляторы способны представить результаты исследования только в секундах, например, показатель протромбинового времени не может быть представлен в показателе международного нормализованного отношения (МНО или INR), т. е. эти показатели можно будет определить или на калькуляторе, или используя специальные таблицы. Используя коагулятор, концентрацию фибриногена хронометрическим методом Клауса придется определить по калибровочной кривой, построенной вручную на калибровочном графике, т. е. такие приборы не предусматривают возможность автоматического представления результатов исследования в граммах/литрах (или в каких‑либо других единицах измерения). Коагуляторы, как правило, однока‑нальные.

Разработка прибора, основанного на оценке движения стального шарика в свертывающейся пробе плазмы или крови, была начата в начале 1990‑х годов сотрудниками ООО «НПО „Медио‑Лаб“ и привела к созданию отечественного механического коагу‑лометра ЭМКО‑02. Серия этих приборов была выпущена и поступила в различные клинико‑диагностические лаборатории страны, однако некоторые технические особенности прибора не позволяли проводить точные измерения в пробах с низким содержанием фибриногена. В настоящее время прибор не производится, хотя какое‑то количество приборов еще эксплуатируется в некоторых клинико‑диагностических лабораториях.

Оптический коагулометр был создан и успешно выпускается в настоящее время сотрудниками ООО «НПО „Астра“ (г. Уфа) при участии ООО „НПО «МедиоЛаб“. Это одноканальный оптико‑механический коагулометр АСКО‑02. Большими достоинствами прибора безусловно являются его высокая надежность и точность измерений, крайняя простота эксплуатации и весьма низкая стоимость, что позволяет говорить о нем как о базовом приборе в своем классе. В работе с прибором возможно использовать любые как отечественные, так и импортные реактивы. Вместе с тем надо отметить, что использование этого прибора целесообразно при достаточно небольшом объеме исследований.

Большой объем исследований системы гемостаза в клинико‑диагностических лабораториях средних и крупных лечебно‑профилактических учреждений может быть своевременно выполнен только при использовании многоканальных полуавтоматических или автоматических систем. Разработка прибора, способного решить эту задачу, была предпринята в последние годы сотрудниками ООО «ВАСМА» (г. Москва) при участии ООО «НПО „Медио‑Лаб“.

В настоящее время новый оптический восьмиканальный программируемый коагулометр АСКО‑08 со встроенным принтером прошел все испытания, зарегистрирован в Министерстве здравоохранения и выпускается серийно.

Принцип работы прибора основан на турбидиметрии коагулируемого образца плазмы при его непрерывном перемешивании магнитной мешалкой. Используемый в приборе принцип измерения значительно повышает его чувствительность и позволяет работать с образцами плазм с низким содержанием фибриногена, что весьма важно при исследовании у тяжелых больных. Помимо этого, конструктивные особенности измерительной части прибора позволяют использовать уменьшенные (по отношению к стандартным) количества реактивов и исследуемой плазмы, что безусловно важно в клинической и прежде всего педиатрической практике.

Сохранение в долговременной памяти прибора калибровочных значений для таких методов, как определение протромбинового времени, фибриногена, факторов свертывания крови, антитромбина III и др., позволяет получать расчетные значения автоматически после проведения измерения. Встроенный в прибор принтер позволяет получать неограниченное количество бланков результатов исследований.

Дата добавления: 2014-11-25 ; Просмотров: 1742 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Реагенты НПО «РЕНАМ» могут быть использованы при работе со всеми видами отечественных и импортных полуавтоматических и автоматических коагулометров!

Все наборы реагентов для определения гемоглобина предназначены для исследований по унифицированному гемиглобинцианидному методу, рекомендованному ВОЗ в качестве единственного стандартного метода.

Плазма контрольная (пул здоровых доноров).

Плазма Н предназначена для контроля исследования следующих параметров:
— протромбиновое время, в % по Квику,
— МНО (протромбиновое отношение);
— протромбиновый индекс, в %
— АЧТВ, в сек;
— тромбиновое время, в сек;
— содержание фибриногена по Клауссу, в г/л;
— активность антитромбина III, в %
— общая система фибринолиза (XIIa-зависимый фибринолиз), в минутах.

Плазма Н пулированная, собрана от 20 доноров в возрасте 20-40 лет, стабилизирована HEPES-цитратным буфером и лиофильно высушена – 6 флаконов (3 фл. с нормальными параметрами системы гемостаза, 3 фл. с искусственно сниженными параметрами системы гемостаза).

Определение содержания фибриногена в плазме крови человека является одним из четырех базовых тестов. Измерения содержания фибриногена в плазме проводят при гиперфибриногенемии, которая связанна с тяжестью воспалительных, иммунных, деструктивных процессов, а также является одним из факторов повышенного риска развития гипервискозного синдрома, артериальных тромбозов и инфарктов органов. Снижение концентрации фибриногена наблюдается при остром ДВС-синдроме, при лечении фибринолитиками, при врожденных гипо- и дисфибриногенемиях.

Состав набора:
— Тромбин для определения фибриногена (2 мл) — 8 флаконов,
— Плазма-калибратор (1 мл) — 1 флакон,
— Буфер имидазоловый концентрированный (5 мл) — 1 флакон.

Протромбин-контроль – пул плазмы, полученный от не менее 20 доноров в возрасте 20-40 лет, плазма стабилизирована HEPES-цитратным буфером и лиофильно высушена. Флаконы силиконированы для предотвращения контактной активации.

Состав набора:
— Протромбин-калибратор, лиофильно высушенный (1,0 мл) – 3 флакона.

АЧТВ является одним из наиболее распространенных и чувствительных тестов для выявления широкого диапазона коагуляционных нарушений. АЧТВ изменяется в зависимости от различных количеств фибриногена, активности протромбина, факторов V, VIII, IX, X, XI, XII, других факторов контакта, присутствия специфических ингибиторов факторов свертывания VIII и IX. АЧТВ является широко применяемым методом контроля эффективности парентерального введения гепарина.

Состав набора:
— АЧТВ-реагент лиофильно высушенный – 7 фл.,
— раствор кальция хлористого 0,025 М (10 мл) – 3 фл.

Набор предназначен для проведения 280 макро- или 560 микроопределений.

Ренампластин – водорастворимый, лиофильно высушенный тромбопластин, полученный из головного мозга кролика с добавлением ионов кальция, аттестованный по МИЧ.

Рекомендуется для контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами. Предназначен для определения протромбинового времени в плазме крови и выражения его результатов в виде МНО, протромбина по Квику, %, протромбинового отношения и протромбинового индекса.

Для работы на полуавтоматических, автоматических коагулометрах и ручным методом.

Состав набора ПГ-5/1:
• Ренампластин, МИЧ 1,1-1,2 (8,0 мл) – 10 флаконов.
1 флакон предназначен для проведения 40 макро- или 80 микроопределений.

Состав набора ПГ-5/2:
• Ренампластин, МИЧ 1,1-1,2 (8,0 мл) – 3 флакона.
1 флакон предназначен для проведения 40 макро- или 80 микроопределений.

Метод полностью соответствует стандартам ВОЗ.

Принцип метода основан на свойстве волчаночного антикоагулянта напрямую ингибировать фосфолипид-зависимые коагуляционные тесты: АЧТВ, протромбиновое время, каолиновое время, время активированного фактора X; в результате время свертывания удлиняется.

Однако это удлинение может быть вызвано также недостаточностью факторов свертывания или присутствием специфических ингибиторов факторов свертывания.

Для выяснения природы ингибирования проводят 3 типа тестов:

1. Сначала исследуют, происходит ли удлинение времени свертывания при проведении вышеперечисленных тестов с реагентами с низким содержанием фосфолипидов. Это скрининг-реагенты.

2. При удлинении времени свертывания выясняют, связано это с дисфункцией факторов свертывания или с присутствием ингибиторов. Для этого проводят тесты с добавлением в инкубационную среду нормальной плазмы, содержащей все факторы свертывания.

3. Для установления наличия ВА-специфических ингибиторов при проведении тех же фосфолипид-зависимых коагуляционных тестов используют реагенты с высоким содержанием фосфолипидов (подтверждающие), которые потребляются волчаночным антикоагулянтом; время свертывания в вышеперечисленных тестах укорачивается. При наличии специфических ингибиторов укорочения времени свертывания не происходит.

Состав набора:

-реагенты АЧТВ, лиофильно высушенные: АЧТВс – 2 фл., АЧТВп – 2 фл.;
-реагенты Рассела, лиофильно высушенные: ВАс – 2 фл., ВАп – 2 фл.;
-реагенты ПВ, лиофильно высушенные: ПВс – 1 фл., ПВп – 1 фл;
-плазма контрольная, содержащая волчаночный антикоагулянт, лиофильно высушенная – 1 фл.

Для проведения исследования дополнительно необходимо использование раствора кальция хлорида 0,025 М.

Тест может использоваться для определения активности факторов внутреннего пути свертывания, для мониторинга действия нефракционированного гепарина. Чувствителен к волчаночному антикоагулянту.

Состав набора:
• Коагуло-реагент (эрилид в суспензии каолина, буфер, стабилизатор), лиофильно высушенный (2,0 мл) – 8 флаконов;
• 0,025 М раствор кальция хлористого (10,0 мл) – 2 флакона.

Набор предназначен для проведения 160 макро- или 320 микроопределений.

Предназначен для контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами.

Состав набора:
• Ренампластин, МИЧ 1,1-1,2 (4,0 мл) – 9 флаконов;
• Консервант для капиллярной крови, концентрат (5,0 мл) – 1 флакон.

Набор предназначен для проведения 360 макро- или 720 микроопределений.

1 Работа на полуавтоматических коагулометрах с использованием реагентов отечественного производства Берковский А. Л., Сергеева Е. В., Кишинец Р.С., Хурдин В.В., Фунт В.А. Методическое руководство

2 Оглавление Введение. 3 Виды коагулометров и принцип их действия. 4 Основные принципы работы на полуавтоматических коагулометрах. 6 Приготовление и хранение реагентов и контрольных материалов. 6 Получение и хранение исследуемой плазмы для анализа. 7 Внешний вид полуавтоматических коагулометров. 8 Технические характеристики полуавтоматических коагулометров Особенности применения реактивов на полуавтоматических коагулометрах Таблица соответствия полуавтоматических коагулометров и применяемых реактивов Наиболее распространенные технические ошибки и рекомендации как их избежать Получение плазмы для анализов Обработка лабораторной посуды Силиконирование стеклянной посуды Требования к приборам Проверка температурного режима коагулометра Калибровка полуавтоматических пипеток Протромбиновое время Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) Тромбиновое время Количественный анализ фибриногена методом Клаусса ЛИТЕРАТУРА. 20

3 Введение Высокое качество лабораторных исследований достигается стандартизацией лабораторных исследований на всех этапах, а именно: преаналитический, аналитический и постаналитический. Наибольшее число ошибок в диагностике системы гемостаза совершается на преаналитическом этапе, однако достаточно часто ошибки происходят и на аналитическом этапе. Ведь не секрет, что при работе на полуавтоматическом коагулометре результат во многом зависит от техники выполнения теста лаборантом. Исследования на этом этапе в максимальной степени стандартизуются применением автоматических коагулометров. Неудивительно, что в последнее время наблюдается тенденция автоматизации лабораторий, поскольку автоматический коагулометр обеспечивает отличную точность и воспроизводимость результатов (стандартизация аналитического этапа), увеличение скорости обработки исследуемого материала, безопасность персонала, возможность предоставления расширенной коагулограммы, возможность проведения тестов с использованием хромогенного субстрата, а также иммунологических тестов. Ниже можно привести основные показатели для установки автоматического коагулометра: 1. Количество пациентов 50 и более в день 2. Необходимость предоставления развернутой коагулограммы 3. Необходимость улучшения качества результатов в Федеральной программе внешней оценки качества (ФСВОК) Нами выпущены пособия по работе на различных видах автоматических коагулометров. Но зачастую лаборатории финансируются недостаточно, чтобы приобрести автоматический коагулометр, поэтому данное методическое пособие будет посвящено принципам работы на наиболее распространенных типах полуавтоматических коагулометров, а также их некоторым особенностям.

4 Виды коагулометров и принцип их действия Коагулометры подразделяютсяя на полуавтоматические и автоматические. Рис.1 Различные виды полуавтоматических коагулометров. Полуавтоматические коагулометры различают по методу регистрации сгустка: механические, оптические и совмещенные. При механическом методе регистрации сгустка используется шарик, который при добавлении в кювету начинает движение относительно кюветы. При образовании сгустка шарик прекращает движение относительно кюветы, что и регистрируют датчики прибора. Рис.2 Различные варианты механической регистрации сгустка При использовании оптического метода регистрации сгустка прибор фиксирует конечный результат по изменению оптических свойств реакционной смеси Существуют также оптико-механические коагулометры, однако по нашему мнению, не стоит их выделять в отдельную группу, поскольку регистрация образования сгустка осуществляется оптическим методом, а механическим способом (шариком или др.) происходит лишь перемешивание тестируемой смеси. Рис. 3 Пример оптической регистрации сгустка К совмещенным относят редкие виды коагулометров, где существует возможность выбора способа регистрации сгустка. Рис. 4 Коагулометры совмещенного типа Минилаб 701 и АПГ-02-П При работе на большинстве полуавтоматических коагулометров не требуется специальных адаптаций при использовании реагентов различных производителей. Однако, следует помнить, что для работы на некторых видах коагулометров должны использоваться специфические виды реагентов. Например, при работе на

5 одном из самых распространенных полуавтоматических коагулометров АПГ-02 (Эмко, Техномедика, Москва), а также Минилаб 701,704 (Юнимед, Москва) при исследовании в оптическом режиме необходимо использование реагентов с содержанием каолина. В ассортименте реагентов торговой марки Ренам представлены реагенты с каолином для исследования активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (Коагуло-тест, Коагуло-экспресс) и для исследования фибриногена по Клауссу (ОптиФибриноген-тест). При работе на реагентах без каолина является обязательным условие перевода вышеуказанных приборов на механический метод детекции сгустка. Следует отметить, что применение оптического метода регистрации сгустка, который реализован во многих полуавтоматических приборах не является обязательным условием применения реагентов с содержанием каолина. Информацию по необходимости применения реагентов с каолином можно получить, изучив инструкцию по использованию полуавтоматического коагулометра в разделе Проведение исследований: Фибриноген по Клауссу. Коагулометры с различными методами регистрации (оптические и механические), за некоторым исключением, не сильно отличаются друг от друга по точности и воспроизводимости регистрации образования сгустка в бедной тромбоцитами плазме, но значительно превосходят мануальные варианты (термобаня) исследования системы гемостаза. Существуют также различные принципы измерений полученных результатов: клоттинговый, (процентный, по конечной точке и кинетический), хромогенный (колориметрический), иммунологический (основанный на регистрации реакции антиген-антитело). В большинстве автоматических коагулометров применяется оптический метод регистрации сгустка. Рис.5 Примеры автоматических коагулометров Работе на данных коагулометрах посвящены отдельные методические пособия, поэтому, мы более подробно рассмотрим особенности работы на разных моделях полуавтоматических коагулометров.

6 Основные принципы работы на полуавтоматических коагулометрах Для получения адекватных и воспроизводимых результатов при работе на полуавтоматических коагулометрах должны быть выполнены следующие требования: — Необходимо правильно подготовить анализируемый образец — Необходимо четко соблюдать инструкцию по использованию реагента и инструкцию по эксплуатации коагулометра (время инкубации реагентов, вносимые объёмы реагентов, прогрев рабочих реагентов и т.д.) — Необходимо соблюдать требование по одномоментному и быстрому внесению стартового реагента в кювету коагулометра (данное требование является одним из самых важных, поскольку именно от действий врача-лаборанта на этом этапе очень сильно зависит конечный результат исследований) — После каждой смены серии реагента необходимо заново строить калибровочные кривые (при проведении исследований, для которых необходимо построение калибровочных кривых) — Необходима ежедневная постановка контрольных материалов в нормальной и патологической областях (внутренний контроль качества) — Необходимо участие во внешнем контроле качества Приготовление и хранение реагентов и контрольных материалов 1. Приготовление реагентов Лиофильно высушенные реагенты необходимо реконструировать строго в соответствии с инструкцией, осторожно внеся требуемое количество дистиллированной воды или растворителя автоматической пипеткой, растворить при покачивании (не встряхивать, избегать образования пены). При необходимости прогреть в закрытом виде при 37ºС в течение времени, указанного в инструкции. Во избежание ошибок на преаналитическом этапе исследования необходимо проводить своевременную периодическую поверку термостатов и подогреваемых ячеек коагулометров, используемых для прогрева реагентов. Если температура отличается от (37±0,5)ºС, следует обратиться в техническую службу для ремонта прибора. 2. Приготовление контрольных и калибровочных плазм Перед использованием внести во флакон с плазмой 1,0 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при осторожном покачивании (избегать образования пены!). Раствор плазмы выдержать при температуре С в течение 20 минут. Для исключения возможности «приборной» погрешности на этапе лабораторного анализа необходимо проводить калибровку всех используемых автоматических пипеток. Большое влияние на стабильность реагентов и контрольных материалов оказывает качество используемой дистиллированной воды, которое должно подвергаться обязательному контролю. Рекомендуется использовать бидистилированную воду или подвергать ее очистке методом обратного осмоса. 3. Хранение и стабильность реагентов и контрольных материалов Хранение разведенных реагентов и плазм должно осуществляться не более времени, указанного в инструкции, в плотно закрытом виде. Все контрольные и калибровочные плазмы производства НПО «Ренам» после разведения стабильны во флаконе изготовителя при комнатной температуре (18-25ºС) до 4

7 часов. Допускается хранение готовых растворов плазм при 2-8ºС от 4 до 8 часов или в замороженном виде от 14 дней до 2 месяцев (согласно инструкции). Для увеличения срока хранения реагенты «Ренам» можно замораживать, при этом в случае соблюдения условий замораживания и оттаивания свойства реагентов и контрольных материалов полностью сохраняются. Для замораживания следует разлить раствор по аликвотам в пластиковые пробирки (до 1 мл), плотно закрыть, быстро заморозить при самой низкой возможной температуре в низкотемпературном холодильнике (морозильнике) и хранить при температуре не выше -18 С. Для сохранения свойств материалов важно правильно замораживать и размораживать реагенты: замораживание должно проводиться как можно быстрее, для этого пластиковую пробирку с аликвотой кладут горизонтально на охлаждаемую металлическую часть морозильной камеры. Температура хранения замороженного образца должна быть не выше -18ºС. Размораживание следует проводить быстро (в течение максимум 5 минут) при температуре, не превышающей 37ºС (при необходимости использовать водяную баню для полного размораживания за указанное выше время). Перед проведением теста нужно убедиться, что во флаконе с реагентом не произошло осаждения вещества (при работе с тромбопластинами это возможно) и в случае необходимости следует осторожно перемешать содержимое флакона при покачивании или поместить во флакон магнитную мешалку (если конструкцией коагулометра предусмотрено перемешивание реагентов). В процессе работы необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматических пипеток, чтобы исключить занос материала в реагент или плазму. Отсутствие перекрестного заноса особенно важно при длительном хранении и замораживании реагентов и плазм. Запрещается использовать реагенты с истекшим сроком годности, хранящиеся дольше времени, указанного производителем, или если наблюдается визуальное изменение свойств готового раствора (помутнение, изменение окраски и т.п.). Получение и хранение исследуемой плазмы для анализа 1. Антикоагулянты для проб крови Для взятия проб крови широко используются такие антикоагулянты, как растворы цитрата натрия и этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). В гемостазиологии цитрат натрия преимущественно применяют для тестирования плазменного гемостаза, а ЭДТА для определения функциональной активности тромбоцитов. Для приготовления растворов цитрата используются два типа соли: двухводный трехзамещенный цитрат натрия (Na 3 C 6 H 5 O 7 2H 2 O) и 5,5-водный трехзамещенный цитрат натрия (Na 3 C 6 H 5 O 7 5,5H 2 O). В вакуумных системах для взятия крови применяют 0,109 М или 0,129 М раствор этого консерванта, что соответствует 3,2% и 3,8% двухводного трехзамещенного цитрата натрия. Во избежание возможного несоответствия между молярной и процентной концентрацией при приготовлении консерванта следует учитывать содержание воды в применяемом реагенте, то есть молекулярную массу гидратированных форм цитрата натрия. В настоящее время по рекомендациям Института Клинических Лабораторных Стандартов (CLSI) предпочтительным является применение 3,2% (0,109 М) цитрата натрия. Эта концентрация цитрата натрия вызывает меньшую частоту преаналитических ошибок. Исследования показали, что использование 3,8% (0,129 М) приводит к удлинению протромбинового времени (ПВ) и АЧТВ и занижению содержания

8 фибриногена в нормальном диапазоне. «Правильная» молярность цитрата натрия принципиально важна в тестах, где критичным является содержание несвязанного Ca 2+. Так, согласно требованиям Всемирной Организации Здравоохранения, во избежание существенных диагностических ошибок при определении Международного Нормализованного Отношения (МНО), для теста ПВ следует использовать 0,109 М раствор трехзамещенного цитрата натрия в соотношении кровь:антикоагулянт = 9:1. Раствор цитрата натрия с концентрацией 0,129 М (3,8%) не должен быть использован в данном тесте. Следует помнить, что ошибки, допущенные на преаналитическом этапе исследования, нельзя скорректировать проведением процедур верификации и внутрилабораторного контроля качества коагулологических тестов. Таким образом, в случае использования вакуумных систем забора крови для коагулологических исследований следует применять только вакуумные пробирки с концентрацией цитрата натрия 3,2%. Другим принципиально важным положением обеспечения правильности проведения анализа является стандартизация соотношения объемов плазмы и цитрата натрия, которое должно составлять трого 9:1 для пациентов с нормальным гематокритом. 2. Получение и хранение плазмы пациентов Для получения бедной тромбоцитами плазмы для стандартных коагулологических исслдеований венозную кровь отобрать в пластиковую пробирку с 3,8% (0,11 моль/л) цитратом натрия в соотношении 9:1 или в вакуумные системы для взятия крови с 3,2% (0,11 моль/л) цитратом натрия, центрифугировать при комнатной температуре (18-25ºС) в течение 15 мин при 3000 об/мин (1200 g). Время хранения исследуемой плазмы до анализа не более 4 ч при комнатной температуре и не более 8 ч при температуре 2-8ºС. Так как после взятия крови происходит быстрое ухудшение состояния образца, проба должна быть как можно скорее поступить в лабортаория для исследования. Транспортируемые пробирки следует держать в вертикальном положении для обеспечения меньшей степени вспенивания, а следовательно, гемолиза. Допускается однократное замораживание плазмы при температуре минус 18-20ºС и хранение при этой температуре не более 2 мес. При этом необходимо учитывать влияние скорости замораживанияоттаивания на показатели гемостаза и проводить эти процедуры быстро для снижения вероятной активации системы свертывания крови (см выше) Внешний вид полуавтоматических коагулометров Behnk Elektronik Trombotimer 4 Behnk Elektronik Trombostat 2 Cormay Coatron 4

9 Dade Behring Fibrintimer III Helena Coadata 400 Helena C 4 Human Humaclot Duo Plus Roche Start 4 Sysmex CA 50 Tcoag Amelung KC 4 Астра АСК-02 АПГ 4-02 Минилаб 701 Минилаб 704 BioMerieux Option 4 Plus TS 4000 Солар CT 2410 Merlin MC 1 (4, 10)

10 Наименование коагулометра Технические характеристики полуавтоматических коагулометров Количество каналов Принцип сгустка детекции Объём реакционной смеси Behnk Elektronik 1/2/4 Оптико-механический 300 мкл Trombotimer 1/2/4 Behnk Elektronik 1/2 Механический 150 мкл Trombostat 1/2 Cormay Coatron M1/2/4 1/2/4 Оптический 150 мкл Dade Behring 2 Оптико-механический 300 мкл Fibrintimer II Helena Coadata 2/4 Оптико-механический мкл 2001/4001 Helena C 1/2/4 1/2/4 Оптический от 75 мкл Human Humaclot Duo 2 Оптический 75 мкл Plus Roche Start 4 4 Механический 300 мкл Sysmex CA 50 4 Оптический 150 мкл Tcoag Amelung KC 4 4 Механический 150 мкл Астра АСК-02 2 Оптический 300 мкл АПГ 2-02/4-02 2/4 Механический/ 150 мкл оптический Минилаб 701 (704) 2/4 Механический/ 150 мкл оптический BioMerieux Option 4 4 Оптический 150 мкл Plus TS Механический 300 мкл Солар CGL2110/ 1/4 Оптический 300 мкл CT 2410 Merlin MC 1 (4, 10) 1/4/10 Механический 150/300 мкл Наименование теста Приблизительная производительность, тестов в час 1 канал/2 канала/4 канала ПВ, ТВ 30/60/120 АЧТВ 15/30/60 Фибриноген 10/20/40

11 Особенности применения реактивов на полуавтоматических коагулометрах В основном, на полуавтоматических коагулометрах, не требуется внесение каких-либо изменений в методику проведения теста. Но иногда возникает необходимость применения определенных реагентов в силу конструктивной особенности коагулометра и его измерительной системы. Для всех видов полуавтоматических коагулометров в качестве реагента для определения протромбинового времени рекомендуется использовать реагент Ренампластин (кат ПГ-5/1, 5/2). Для определения АЧТВ можно использовать АЧТВ-тест (кат ПГ-7/1). Для определения тромбинового времени лучше применять тромбин-реагент (кат ПГ-9А). Также, хотелось бы отметить, что все вышеперечисленные параметры необходимо контролировать с помощью контрольных плазм, аттестованных в нормальной и патологической области системы гемостаза (Плазма Н (кат КМ-1), Плазма контрольная патологическая (кат. КМ-3)). Для построения калибровочной прямой при определении активности протромбина в процентах от нормы рекомендуется использовать Протромбин-калибратор (кат КМ-18). Для контроля правильности определения МНО желательно использовать Протромбин-контроль (кат КМ- 17). При определении уровня фибриногена на различных полуавтоматических коагулометрах требуются различные тест-системы (с содержанием каолина в смеси и без него). Реагент, не содержащий каолин, называется Фибриноген-тест (кат ПГ-10/1). Он используется, обычно, в коагулометрах с механическим методом регистрации сгустка и в некоторых оптических системах. Реагент с каолином — Оптифибриногентест (кат ПГ-11/1) используется в некоторых коагулометрах с оптическим методом регистрации сгустка. Обычно, рекомендации по применению реагентов с каолином прописаны в инструкции по эксплуатации коагулометра, в разделе «Определение уровня фибриногена». При построении калибровочной кривой для определения содержания фибриногена чаще всего используют рекомендации, приведенные в инструкции к реагенту (рекомендуемые разведения плазмы-калибратора: 1/5, 1/10, 1/20, 1/40). Однако, в некоторых случаях, также необходимо учитывать технические особенности и рекомендации для конкретных моделей коагулометров. Для того, чтобы было проще подобрать правильные тест-системы к конкретной модели коагулометра мы приводим таблицу соответствия реактивов и коагулометров при определении фибриногена по Клауссу:

12 Таблица соответствия полуавтоматических коагулометров и применяемых реактивов Наименование коагулометра Behnk Elektronik Trombotimer 1/2/4 Behnk Elektronik Trombostat 1/2 Cormay Coatron M1/2/4 Dade Behring Fibrintimer II Helena Coadata 2001/4001 Helena C 1/2/4 Human Humaclot Duo Plus Roche Start 4 Sysmex CA 50 Tcoag Amelung KC 4 Астра АСК-02 АПГ 2-02/4-02 Минилаб 701 (704) BioMerieux Option 4 Plus TS 4000 Солар CGL2110/ CT 2410 Merlin MC 1 (4, 10) Используемые реактивы для определения фибриногена и особенности измерений Оптифибриноген-тест Фибриноген-тест Фибриноген-тест ОптиФибриноген-тест Оптифибриноген-тест Фибриноген-тест Фибриноген-тест Фибриноген-тест Фибриноген-тест Рекомендуемые разведения плазмыкалибратора:1/7,5;1/15;1/20;1/30 Фибриноген-тест Фибриноген-тест Оптифибриноген-тест Оптифибриноген-тест При определении содержания фибриногена объем реакционной смеси должен составлять 300 мкл Оптифибриноген-тест Фибриноген-тест Оптифибриноген-тест Фибриноген-тест

13 Наиболее распространенные технические ошибки и рекомендации как их избежать Наиболее распространенные технические ошибки, возникающие при исследовании гемостаза, связаны со следующим: неправильное взятие проб крови, при котором уже произошла активация процесса свертывания; неправильное соотношение объемов крови и антикоагулянта; попадание гепарина в пробу (выраженное удлинение АЧТВ); неправильная температура термостатирования при проведении тестов; использование несиликонизированной стеклянной посуды (активация свертывания); многократное использование пластиковой одноразовой посуды (активация свертывания); использование для мытья посуды детергентов, влияющих на свертывание. Получение плазмы для анализов Кровь следует брать утром, натощак, из локтевой вены, иглой, как можно большего диаметра, без шприца и без наложения жгута. Первые капли крови отбрасывают, т.к. в них может содержаться тканевой активатор системы гемостаза. Кровь сразу после забора смешивают (в силиконированной стеклянной или в пластиковой пробирке) с раствором натрия лимоннокислого (цитрата) в соотношении 9:1 до получения конечной концентрации цитрата натрия Для исследования плазменного звена гемостаза используют плазму крови, обедненную по тромбоцитам. Данную плазму получают путем центрифугирования цитратной крови в течение 15 мин при 3000-об/мин (ускорение 1200 g). Плазму рекомендуется хранить при комнатной температуре (18-25 С), если ее используют для определения протромбинового времени, анализа активности фактора VII или для исследования функций тромбоцитов, т.к. при 2-8 С происходит активация фактора VII. Для проведения всех прочих тестов плазму хранят при температуре 2-8 С. Обязательным условием является проведение всех анализов не позднее, чем в течение 2 часов после взятия крови. Допускается однократное замораживание проб бедной тромбоцитами плазмы при температуре С на срок до нескольких недель. Не рекомендуется замораживание исследуемой плазмы на срок, более чем 2 недели при проведении исследований на определение активности фактора VIII.

14 Обработка лабораторной посуды Для обеспечения точности и воспроизводимости результатов анализа системы гемостаза большое внимание необходимо уделять подготовке лабораторной посуды: пробирок, кювет, пипеток. Наиболее целесообразней использовать для этого одноразовую пластиковую посуду, что и практикуется за рубежом. При необходимости повторного использования лабораторной посуды, в том числе стеклянной, ее нужно правильно очищать. Недопустимо применение хромпика, различных стиральных порошков, т.к. даже в минимальном количестве хромовые смеси ингибируют факторы свертывания крови, а детергенты снижают воспроизводимость результатов. Мы рекомендуем пластиковую и стеклянную посуду (кюветы, пробирки, наконечники пипеток) после использования обрабатывать в течение 2-3 час в 6% растворе перекиси водорода в ультразвуковой мойке. Затем посуду необходимо тщательно промыть в проточной воде, сполоснуть в дистиллированной воде и высушить. Пластиковую Посуду сушат на воздухе, стеклянную в сушильном шкафу при температуре С в течение 1-2 часов. После промывания и высушивания стеклянную посуду необходимо силиконировать. Силиконирование стеклянной посуды Для исследования системы гемостаза рекомендуется использовать одноразовую пластиковую посуду. При невозможности использования пластиковой посуды стеклянную посуду перед работой силиконируют покрывают тонким слоем силана. Вся процедура силиконирования проводится только в вытяжном шкафу. Чаще всего применяют диметилдихлорсилан. 5 % раствором этого силана в толуоле заполняют чистые сухие стеклянные пробирки, затем раствор сливают для повторного использования. Стеклянные пипетки наполняют из резиновых груш. Затем посуду высушивают на воздухе в вытяжном шкафу в течение часов и досушивают при температуре С в сушильном шкафу. После 4-5 кратного использования силиконирование посуды повторяют. Требования к приборам Все коагулометры перед использованием требуют проверки и сопоставления данных анализа с результатами, полученными ручным методом. Необходимо убедиться также в правильности показаний температуры и в правильности регистрации конечной точки реакции. Следует постоянно проверять работу всех коагулометров. При сравнивании результатов тестирования, полученных при работе с разными коагулометрами, нужно помнить, что приборы по-разному регистрируют конечную точку реакции, что сказывается на полученных данных. У водяных бань температура не должна варьировать в пределах, превышающих ± 0,5 С.

15 Проверка температурного режима коагулометра При пользовании коагулометрами необходимо периодически проверять температурный режим термостата прибора, учитывая, что температура существенно влияет на результаты анализа. Рекомендуется следующая процедура проверки: 1. Включить коагулометр и выдержать время, достаточное для выхода термостата на рабочий режим, согласно инструкции, прилагаемой к прибору. 2. В ячейку термостата поместить стеклянную пробирку с 5,0 мл дистиллированной воды и выдержать 15 мин. 3. Зафиксировать температуру воды термометром. 4. В случае если температура отличается от значения 37±0,5, необходимо обратиться в техническую службу для ремонта прибора. Калибровка полуавтоматических пипеток Анализы проводят с использованием полуавтоматических пипеток, производства различных фирм (фирма Ленпипет, Россия; пипетки Biohit, фирма Biohit, Финляндия; пипетки Pipetman, фирма Gilson,Франция и др.). При работе с полуавтоматическими пипетками в раствор следует погружать только кончик пипетки на глубину не более 0,4 см. Калибровка полуавтоматических пипеток проводится с целью обеспечения точности исследований. Принято проводить 2 калибровки: — раз в неделю проводится полная калибровка, когда все измерения повторяют по 10 раз и рассчитывают среднее арифметическое значение; — непосредственно перед работой осуществляют рабочую калибровку, когда измерение проводят 1 раз. Процедура калибровки: 1. В стеклянную колбу вместимостью мл налить мл дистиллированной воды, поместить в воду термометр и измерить температуру воды. 2. На аналитических весах взвесить стеклянный стаканчик (или пенициллиновый флакон) вместимостью 5,0-10,0 мл. 3. Набрать в калибруемую пипетку дистиллированную воду, перенести воду из пипетки в стеклянный стаканчик и взвесить стаканчик вместе с водой на аналитических весах. 4. Определить вес воды как разность между весом стаканчика с водой и без воды. 5. Повторить операции 1-3 не менее 10 раз.

16 6. Вычислить среднее арифметическое значение всех измерений веса воды по формуле (1): Е=ΣЕi (1), n где: Е — среднее арифметическое значение веса воды в пипетке, ΣЕi — суммарный вес воды от всех измерений, n — число измерений веса воды. 1) Вычислить объем пипетки (V, мкл)) по формуле (2): V=E/ρ (2), Где: ρ — плотность воды при температуре измерения. Протромбиновое время Рекомендации, позволяющие избежать наиболее типичных ошибок при определении протромбинового времени: 1. При приготовлении растворов цитрата натрия необходимо помнить, что эта соль может содержать разное количество кристаллизационной воды, и рекомендуется использовать точно приготовленные и проверенные растворы фирмы НПО «РЕНАМ» (см. раздел «Получение плазмы для анализов»). 2. При использовании вакуумных систем для забора крови необходимо обращать внимание на концентрацию цитрата натрия, указанную на пробирке 3,2 % или 0,105-0,109 М. При использовании пробирок с концентрацией цитрата натрия 3,8 % (0,129 М) возможно удлинение времени свертывания в тестах ПВ и АЧТВ. 3. Плазму, приготовленную для анализа протромбинового времени, следует хранить не более 2 часов при комнатной температуре, поскольку охлаждение плазмы до температуры 2-7 градусов может вызвать холодовую активацию фактора VII и может оказывать влияние на время реакции, в сторону укорочения. 4. Необходимо понимать различия в способах выражения результатов теста протромбинового времени (протромбиновое отношение (ПО), протромбиновый индекс (ПИ), активность протромбина в процентах от нормы (% по Квику), международное нормализованное отношение (МНО)). Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) Рекомендации, позволяющие избежать наиболее типичных ошибок при определении (АЧТВ): 1. Кровь нельзя брать через катетер, которым пользовались для инъекций гепарина. Происходит значительное увеличение АЧТВ из-за контаминации следами гепарина.

17 2. Нельзя использовать для анализов кровь с микросгустками, т.к. в такой крови уже начался процесс свертывания и АЧТВ будет укорочено. 3. Нельзя использовать для анализов частично гемолизованную кровь, т.к. при этом происходит изменение нормальной длительности АЧТВ более чем на 10%, т.к. продукты гемолиза эритроцитов обладают выраженным прокоагулянтным действием. 4. При взятии крови нельзя допускать травмирования прилежащих тканей и сосудов, т.к. при этом выделяются тканевые факторы, активизирующие свертывание крови и укорачивающие АЧТВ. 5. Плазму крови нельзя инкубировать при температуре 37 С более 5 мин, чтобы не допустить инактивации лабильных V и VIII факторов свертывания крови. 6. Не рекомендуется использовать для приготовления 0,025 М раствора кальция хлористого аптечный раствор в ампулах, т.к. концентрация этого раствора в ампулах, как показали наши исследования, зачастую определена неточно. 7. Анализы проводить в посуде, не содержащей активаторов или ингибиторов свертывания (хорошо промытая дистиллированной водой, без применения моющих средств). Тромбиновое время Рекомендации, позволяющие избежать наиболее типичных ошибок при определении тромбинового времени. 1. Кровь нельзя брать через катетер, которым пользовались для инъекций гепарина. Происходит значительное увеличение тромбинового времени из-за контаминации следами гепарина. 2. Стабилизированный раствор тромбина рекомендуется хранить в исходных флаконах, не переливать. 3. В случае длительного использования стабилизированного раствора тромбина допускается разделить его на аликвоты с учетом разовой используемой дозы и хранить в пластиковых пробирках (желательно, новых). 4. Рабочий раствор тромбина следует готовить непосредственно перед использованием и только в пластиковой посуде, учитывая, что тромбин сорбируется стеклом. 5. Рабочий раствор тромбина нельзя использовать для анализов сразу после приготовления, его следует выдержать в течение мин при комнатной температуре (18-25 С). Количественный анализ фибриногена методом Клаусса Рекомендации, позволяющие избежать наиболее типичных ошибок: 1. Набор предназначен для определения фибриноген по Клауссу только с помощью коагулометров, ручной метод использовать нельзя. 2. Следует внимательно читать инструкцию по применению набора по разделу построения

18 калибровочного графика. Необходимо помнить, что время свертывания фибриногена под действием тромбина обратно пропорционально содержанию фибриногена только при низких концентрациях последнего, поэтому все исследуемые образцы плазмы необходимо разводить в 10 раз буфером для разведения образцов плазмы. Наборы реагентов НПО Ренам и полуавтоматические коагулометры НПО «РЕНАМ» с момента своего создания (1990 г.) и по настоящее время является наиболее авторитетным производителем диагностических тест-систем и отдельных реагентов для исследования системы гемостаза в России и странах СНГ. Ассортимент производимых компанией тест-систем, включающий реагенты для четырех базовых коагуляционных тестов: протромбиновое время, АЧТВ, тромбиновое время и фибриноген, а также для тестов для дифференциальной диагностики нарушений в системе свертывания: анализ факторов свертывания, диагностика тромбофилических состояний, гемофилии, системной красной волчанки, мониторинг антикоагулянтной терапии, исследования фибринолиза и функций тромбоцитов, является самым широким среди отечественных производителей. Преимуществом реагентов НПО «РЕНАМ» является также их готовность к применению, поскольку реагенты требуют минимальной предварительной подготовки. Например, титрованные 0,025 М растворы кальция хлористого НПО «РЕНАМ» полностью готовы к применению, что, безусловно, исключает ошибки при разведении концентрированных растворов кальция хлористого, которыми комплектуются наборы других отечественных производителей. Все тромбопластины НПО «РЕНАМ» изготавливаются из ацетонового порошка мозговой ткани кроликов, что обеспечивает гарантию в отсутствии вирусной контаминации гепатитом В, С, ВИЧ и др. вирусами, длительно сохраняющимися в тканях. Рабочие растворы реагентов имеют высокую стабильность при хранении как при комнатной температуре, так и в холодильнике. Кроме того, их можно замораживать при 20 0 С на длительный срок без потери активности. Неоспоримым достоинством продукции НПО «РЕНАМ» является ее высокое качество, поскольку каждая партия производимых реагентов и контрольных материалов подлежит обязательной аттестации с помощью международных стандартов. Компания НПО «РЕНАМ» участвует на постоянной основе в программе Международного контроля качества ВОЗ (UK NEQAS, ECAT) и является поставщиком Федеральной Службы Внешней Оценки Качества лабораторных исследований РФ. Высокая технологичность и соответствие внутренним и международным стандартам обеспечивают продукции НПО «РЕНАМ» универсальность в отношении к уровню автоматизации

19 процесса исследования гемостаза (ручной, полуавтоматический или полностью автоматизированный метод регистрации). Также ее использование не зависит от принципа регистрации сгустка при работе на коагулометрах. Компания НПО «РЕНАМ» производит наборы реагентов как для клоттинговых измерений, так и включающие хромогенные субстраты, необходимые для оптических измерений. Наиболее распространенными в России из отечественныхкоагулометров: «Минилаб 701, 704» (ЗАО «Юнимед», Москва), АПГ (ЗАО «НПП «Техномедика», Москва), «Астра» (Уфа), из зарубежных: марки Behnk Elektronik (Германия), Heinrich Amelung GmbH (Германия). Helena (Англия), Sysmex (Япония), Dade Behring (Германия) и других производителей. Опыт применения реагентов НПО «РЕНАМ» в лечебно-диагностических учреждениях РФ показывает, что наша продукция абсолютно совместима с любыми полуавтоматическими коагулометрами независимо от производителя, а также отлично заменяет реагенты иностранных производителей полных автоматов открытого типа, не снижая уровень точности и воспроизводимости получаемых результатов. Перевод автоматических анализаторов на реагенты НПО «РЕНАМ» практически не требует вмешательства в настройки программы выполнения тестов.

источник