Билирубин и его фракции
Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:
1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;
2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;
3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.
4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;
5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;
6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.
Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.
Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции
Принцип
Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.
Нормальные величины
| Сыворотка (диазореакция) | Прямой билирубин | ||
| Взрослые | 2,2‑5,1 мкмоль/л | ||
| Общий билирубин | |||
| Дети | Доношенные | Недоношенные | |
| кровь из пуповины | Завышенные результаты вызывает гемолиз, прием стероидных препаратов, эритромицина, фенобарбитала, употребление пищи, содержащей каротиноиды (морковь, абрикосы). Длительное стояние сыворотки на свету вызывает окисление билирубина и занижает значения. | ||
Клинико‑диагностическое значение
Сыворотка
Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:
1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.
В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.
У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.
2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.
Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.
В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.
3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.
В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).
В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.
Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.
Амниотическая жидкость
Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.
источник
Лабораторная работа № 14 Количественное определение общего билирубина в сыворотке крови по методу Ендрассика и Клехгорна.
Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина в сыворотке крови.
Мотивация: Билирубин продукт ферментативного окисления гемоглобина (конечный продукт распада гема), образующийся в результате естественного распада эритроцитов в клетках РЭС, относится к группе желчных пигментов. Билирубин вещество токсичное, т.к. молекула билирубина является гидрофобной и может проникать в клетки головного мозга. Поэтому в организме человека существуют реакция обезвреживания билирубина, которая протекает в печени.
где УФДГК кофермент уридиндифосфат глюкуроновая кислота, УДФГТ фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.
Билирубиндиглюкуронид экскретируется с желчью в ЖКТ, где высвобождается из коньюгата, восстанавливается до уробилиногена, затем превращается в стеркобилиноген, в форме которого и выводится из организма человека.
Принцип метода: в основе определения билирубина лежит реакция азосочетания билирубина с диазосмесью Эрлиха, в результате которой появляется малиновокрасная окраска за счет образующегося азобилирубина. Концентрация последнего определяется фотоколориметрически.
Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно (прямой билирубин по старой терминологии), тогда как свободный билирубин неустойчив в растворе в сильно кислой среде, при которой происходит реакция азосочетания и требует присутствия стабилизатора, роль которого могут играть кофеин, спирт, мочевина, ацетат, бензонат натрия и др. (непрямой билирубин).
1. Химические пробирки, бюретки, пипетки на 10мл и 1 мл; 2. Раствор сульфаниловой кислоты 0,5%; 3. Раствор нитрита натрия 0,5% (готовится еженедельно); 4. Кофеиновый реактив: кофеина чистого 5г, бензойнокислого натрия – 37,5г, уксуснокислого натрия – 62,5г, растворяются при нагревании: раствор доводится дистиллированной водой до 1л; 5. Сыворотки крови с различными концентрациями билирубина.
Ход работы: в химическую пробирку из бюреток отмеривают 1 мл сыворотки и 2,5 мл кофеинового реактива. Диазосмесь готовят в одной пробирке на всю группу следующим образом: 10 мл 0,5% раствора сульфаниловой кислоты и 0,25мл 0,5% нитрита натрия отмеривают пипеткой в пробирку из склянки на столе преподавателя. Готовую диазосмесь отмеривают пипеткой по 0,5мл в каждую пробу с сывороткой. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на 20 минут в темноту, затем фотометрируют с зеленым светофильтром (длина волны 530 нм), в кюветах 10 мм против контрольной пробы, в которой вместо сыворотки используют 1 мл дистиллированной воды.
Х= (6,34Д) – 0,05 = мг% 17,1 = мкмоль/л
где D – оптическая плотность
0,05 – поправка на окраску диазосмеси с кофеиновым реактивом
17,1 –коэффициент перерасчета в единицах СИ
Клинико-диагностическое значение определения
общего билирубина в сыворотке крови
В крови здорового человека уровень общего билирубина равен 8,5 20,5 мкмоль/л (0,4 0,8 мг/дл), причем около 75% этого количества приходится на долю непрямого билирубина (6,4 15,4 мкмоль/л).
Повышение содержания общего билирубина более 20,5 мкмоль/л называется гипербилирубинемией и является симптомом различных физиоло-гических и патологических состояний. Гипербилирубинемия более 3035 мкмоль/л сопровождается желтушной окраской склер и кожных покровов.
Физиологическая гипербилирубинемия это так называемая неонаталь-ная физиологическая желтуха новорожденных. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, что является следст-вием с одной стороны интенсивного гемолиза эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин (НbF), а с другой стороны, следствием незрелости гепатоцитов по захвату, коньюгации и экскреции коньюгированного билирубина.
Патологическая гипербилирубинемия может быть вызвана различными причинами, например:
гемолитическая гипербилирубинемия (гемолитическая желтуха) является следствием массивного гемолиза эритроцитов. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, при возможном повыше-нии и коньюгированного (прямого) билирубина. В свою очередь причины гемолиза делятся на биологические (малярия, переливание крови несовмести-мой по группе или резус-фактору) и химические (действие сильных окислите-лей и других тиоловых ядов, врожденные заболевания с гемолизом, например гемоглобинопатии (серповидноклеточная анемия) и энзимопатии (в частности по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе и метгемоглобинредуктазе).
врожденная неконьюгированная гипербилирубинемия (врожденная неге-
молитическая желтуха) является следствием метаболического дефекта в коньюгации билирубина за счет отсутствия или крайней низкой активности УДФГТ, что наблюдается при синдроме КлиглераНайяра и синдроме Жильбера. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина.
токсическая гипербилирубинемия (паренхиматозная желтуха) является следствием поражения клеток печени вирусами (вирус гепатита А, В, С, Д, цитомегаловирус), гепатотропными ядами (хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен, галотан, ацетаминофен (парацетомол), изониазид, рифампицин, -аманитин (токсин бледной поганки) и др.), а также имеет место при циррозе печени (синдром гепатоцеллюлярной недостаточности). Общий билирубин повышен преимущественно за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина. Коньюгированный (прямой) билирубин может быть в норме или повышен (при цитолизе).
коньюгированная гипербилирубинемия (обтурационная, холестатическая желтуха) является следствием механического препятствия оттоку желчи, что наблюдается при желчно-каменной болезни (калькулезный холецистит) и при наличии опухоли, перекрывающей желчевыводящие пути (опухоль главного желчевыводящего протока, опухоль головки поджелудочной железы и др.). Общий билирубин повышен за счет коньюгированного (прямого) билирубина.
врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая идиопа-тическая желтуха) является следствием дефекта в экскреции коньюгирован-ного билирубина в желчь. Наблюдается при синдроме Дубина-Джонсона. Общий билирубин повышен за счет прямого билирубина. При гистологи-ческом исследовании ткани печени выявляется меланоз с неидентифицированным пигментом.
врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая негемо-литическая желтуха) предположительно является следствием нарушения экскреторной функции печени, наблюдается при синдроме Ротора, при гистологическом исследовании ткани печени патологических изменений не находят.
Неконьюгированный билирубин может проходить гематоэнцефалический барьер в случае его повышенного содержания в крови и приводить к пораже-нию мозга (ядерная желтуха). Для предотвращения развития энцефалопатии применяют индукторы УДФГТ (фенобарбитал, люминал), например для коррекции состояния у недоношенных новорожденных детей.
Тестовый контроль по теме: Химия крови.
Выберите правильнЫй ответ
Непрямой билирубин превращается в прямой билирубин связываясь:
а) с сывороточным альбумином
б) в печени с бензойной кислотой
в) в печени с ФАФС (3-фосфоаденин 5-фосфосульфат)
г) в печени с уридинфосфоглюкуроновой кислотой (УДФ ГК)
Выберите правильнЫй ответ
Причиной порфирий является:
б) нарушение синтеза глобина
в) нарушение синтез билирубина
г) нарушение образования в кишечнике уробилиногена, стеркобилино-гена и стеркобилина
д) нарушение проницаемости мембран эритроцита
Выберите правильнЫй ответ
б) 4 полипептидных цепей -1,-2,-1, -2, соединенного с 4 молекулами гема
в) 1 полипептидной цепи, соединенной с одной молекулой гема
г) 2 полипептидных цепей, соединеных с 2 молекулами гема
д) 2 полипептидных цепей, соединенных с 1 молекулой гема
Выберите правильнЫй ответ
Причина серповидной клеточной анемии:
а) нарушение процесса всасывания железа
в) изменение в результате мутации первичной структуры полипептидной цепи
г) изменена вторичная структура -1, -2, -1, -2 цепей
д) изменена третичная структура -1, -2, -1, -2
источник
Лабораторная работа № 14 Количественное определение общего билирубина в сыворотке крови по методу Ендрассика и Клехгорна.
Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина в сыворотке крови.
Мотивация: Билирубин продукт ферментативного окисления гемоглобина (конечный продукт распада гема), образующийся в результате естественного распада эритроцитов в клетках РЭС, относится к группе желчных пигментов. Билирубин вещество токсичное, т.к. молекула билирубина является гидрофобной и может проникать в клетки головного мозга. Поэтому в организме человека существуют реакция обезвреживания билирубина, которая протекает в печени.
где УФДГК кофермент уридиндифосфат глюкуроновая кислота, УДФГТ фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.
Билирубиндиглюкуронид экскретируется с желчью в ЖКТ, где высвобождается из коньюгата, восстанавливается до уробилиногена, затем превращается в стеркобилиноген, в форме которого и выводится из организма человека.
Принцип метода: в основе определения билирубина лежит реакция азосочетания билирубина с диазосмесью Эрлиха, в результате которой появляется малиновокрасная окраска за счет образующегося азобилирубина. Концентрация последнего определяется фотоколориметрически.
Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно (прямой билирубин по старой терминологии), тогда как свободный билирубин неустойчив в растворе в сильно кислой среде, при которой происходит реакция азосочетания и требует присутствия стабилизатора, роль которого могут играть кофеин, спирт, мочевина, ацетат, бензонат натрия и др. (непрямой билирубин).
1. Химические пробирки, бюретки, пипетки на 10мл и 1 мл; 2. Раствор сульфаниловой кислоты 0,5%; 3. Раствор нитрита натрия 0,5% (готовится еженедельно); 4. Кофеиновый реактив: кофеина чистого 5г, бензойнокислого натрия – 37,5г, уксуснокислого натрия – 62,5г, растворяются при нагревании: раствор доводится дистиллированной водой до 1л; 5. Сыворотки крови с различными концентрациями билирубина.
Ход работы: в химическую пробирку из бюреток отмеривают 1 мл сыворотки и 2,5 мл кофеинового реактива. Диазосмесь готовят в одной пробирке на всю группу следующим образом: 10 мл 0,5% раствора сульфаниловой кислоты и 0,25мл 0,5% нитрита натрия отмеривают пипеткой в пробирку из склянки на столе преподавателя. Готовую диазосмесь отмеривают пипеткой по 0,5мл в каждую пробу с сывороткой. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на 20 минут в темноту, затем фотометрируют с зеленым светофильтром (длина волны 530 нм), в кюветах 10 мм против контрольной пробы, в которой вместо сыворотки используют 1 мл дистиллированной воды.
Х= (6,34Д) – 0,05 = мг% 17,1 = мкмоль/л
где D – оптическая плотность
0,05 – поправка на окраску диазосмеси с кофеиновым реактивом
17,1 –коэффициент перерасчета в единицах СИ
Клинико-диагностическое значение определения
общего билирубина в сыворотке крови
В крови здорового человека уровень общего билирубина равен 8,5 20,5 мкмоль/л (0,4 0,8 мг/дл), причем около 75% этого количества приходится на долю непрямого билирубина (6,4 15,4 мкмоль/л).
Повышение содержания общего билирубина более 20,5 мкмоль/л называется гипербилирубинемией и является симптомом различных физиоло-гических и патологических состояний. Гипербилирубинемия более 3035 мкмоль/л сопровождается желтушной окраской склер и кожных покровов.
Физиологическая гипербилирубинемия это так называемая неонаталь-ная физиологическая желтуха новорожденных. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, что является следст-вием с одной стороны интенсивного гемолиза эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин (НbF), а с другой стороны, следствием незрелости гепатоцитов по захвату, коньюгации и экскреции коньюгированного билирубина.
Патологическая гипербилирубинемия может быть вызвана различными причинами, например:
гемолитическая гипербилирубинемия (гемолитическая желтуха) является следствием массивного гемолиза эритроцитов. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, при возможном повыше-нии и коньюгированного (прямого) билирубина. В свою очередь причины гемолиза делятся на биологические (малярия, переливание крови несовмести-мой по группе или резус-фактору) и химические (действие сильных окислите-лей и других тиоловых ядов, врожденные заболевания с гемолизом, например гемоглобинопатии (серповидноклеточная анемия) и энзимопатии (в частности по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе и метгемоглобинредуктазе).
врожденная неконьюгированная гипербилирубинемия (врожденная неге-
молитическая желтуха) является следствием метаболического дефекта в коньюгации билирубина за счет отсутствия или крайней низкой активности УДФГТ, что наблюдается при синдроме КлиглераНайяра и синдроме Жильбера. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина.
токсическая гипербилирубинемия (паренхиматозная желтуха) является следствием поражения клеток печени вирусами (вирус гепатита А, В, С, Д, цитомегаловирус), гепатотропными ядами (хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен, галотан, ацетаминофен (парацетомол), изониазид, рифампицин, -аманитин (токсин бледной поганки) и др.), а также имеет место при циррозе печени (синдром гепатоцеллюлярной недостаточности). Общий билирубин повышен преимущественно за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина. Коньюгированный (прямой) билирубин может быть в норме или повышен (при цитолизе).
коньюгированная гипербилирубинемия (обтурационная, холестатическая желтуха) является следствием механического препятствия оттоку желчи, что наблюдается при желчно-каменной болезни (калькулезный холецистит) и при наличии опухоли, перекрывающей желчевыводящие пути (опухоль главного желчевыводящего протока, опухоль головки поджелудочной железы и др.). Общий билирубин повышен за счет коньюгированного (прямого) билирубина.
врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая идиопа-тическая желтуха) является следствием дефекта в экскреции коньюгирован-ного билирубина в желчь. Наблюдается при синдроме Дубина-Джонсона. Общий билирубин повышен за счет прямого билирубина. При гистологи-ческом исследовании ткани печени выявляется меланоз с неидентифицированным пигментом.
врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая негемо-литическая желтуха) предположительно является следствием нарушения экскреторной функции печени, наблюдается при синдроме Ротора, при гистологическом исследовании ткани печени патологических изменений не находят.
Неконьюгированный билирубин может проходить гематоэнцефалический барьер в случае его повышенного содержания в крови и приводить к пораже-нию мозга (ядерная желтуха). Для предотвращения развития энцефалопатии применяют индукторы УДФГТ (фенобарбитал, люминал), например для коррекции состояния у недоношенных новорожденных детей.
Тестовый контроль по теме: Химия крови.
Выберите правильнЫй ответ
Непрямой билирубин превращается в прямой билирубин связываясь:
а) с сывороточным альбумином
б) в печени с бензойной кислотой
в) в печени с ФАФС (3-фосфоаденин 5-фосфосульфат)
г) в печени с уридинфосфоглюкуроновой кислотой (УДФ ГК)
Выберите правильнЫй ответ
Причиной порфирий является:
б) нарушение синтеза глобина
в) нарушение синтез билирубина
г) нарушение образования в кишечнике уробилиногена, стеркобилино-гена и стеркобилина
д) нарушение проницаемости мембран эритроцита
Выберите правильнЫй ответ
б) 4 полипептидных цепей -1,-2,-1, -2, соединенного с 4 молекулами гема
в) 1 полипептидной цепи, соединенной с одной молекулой гема
г) 2 полипептидных цепей, соединеных с 2 молекулами гема
д) 2 полипептидных цепей, соединенных с 1 молекулой гема
Выберите правильнЫй ответ
Причина серповидной клеточной анемии:
а) нарушение процесса всасывания железа
в) изменение в результате мутации первичной структуры полипептидной цепи
г) изменена вторичная структура -1, -2, -1, -2 цепей
д) изменена третичная структура -1, -2, -1, -2
источник