Определение общего и прямого билирубина методом йендрашика

Унифицированный метод определения билирубина по диазореакции (метод Ендрассика-Грофа)

Принцип метода: Под воздействием НСI разрывается связь билирубина и образуется два дипиррола, которые диазотируются диазобензо сульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 125 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до 50-60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят водой до 100 мл.

5. Натрия хлорид: 154 ммоль/л (изотонический раствор: 0,9 г хлорида натрия в 100 мл воды.

8. Диазосмесь. Диазореактив 1: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300-400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСI, раствор доливают до 1 л. Диазореактив 2: натрия нитрит 5г/л: 0,5 г нитрита натрия в 100 мл воды. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива 1 и 0,3 мл диазореактива 2.

9. Билирубин для построения калибровочного графика 800 мг/л.

10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного Na₂СО₃ растворяют и доводят до 1 л водой.

11. Уксусная кислота, 4 моль/л; 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл водой.

Ход определения: В три пробирки: две опытные и одну холостую вносят реактивы: по 0,5 мл сыворотки крови, кофеиновый реактив вносят в первую опытную пробирку для определения общего билирубина и в холостую пробу по 1,75 мл, во вторую опытную не вносят. Затем во вторую опытную (это определение связанного билирубина) прибавляют 1,75 мл и в холостую пробу 0,25 мл раствора хлорида натрия. Вносят диазосмесь в первую и во вторую опытные пробирки по 0,25 мл.

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5-10 минут после добавления диазосмеси, при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 минут, после чего измеряют на ФЭК при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику.

Основной раствор билирубина: в колбе на 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30-35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na₂СО₃ и несколько раз перемешивают, доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором карбоната натрия.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. Этот раствор содержит на 100 мг/л билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для ее приготовления смешивают 13,9 мл той же сыворотки, 2мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 минут.

Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным: в 5 пробирок прибавляют 0,05 мл; 0,1 мл; 0,15 мл; 0,2 мл; 0,25 мл рабочего раствора билирубина, добавляют с первой по пятую: 0,45 мл; 0,4 мл; 0,35 мл; 0,3 мл; 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия. В пробах количество билирубина соответствует с первой по пятую пробирки: 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025 мг. Концентрация билирубина в сыворотке крови: 17,1 мкмоль/л; 34,2 мкмоль/л; 51,3 мкмоль/л; 68,4 мкмоль/л; 85,5 мкмоль/л.

Нормальные величины. В сыворотке крови содержится 8,5-20,5 мкмоль/л общего билирубина, из которого 75% приходится на долю свободного билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Билирубин по Йендрашику (Серия 300)

Только для IN VITRO диагностики!

• Кат.№ 326.1.400 — 400 определений (при конечном объеме 2 мл)

Принцип метода:

В результате реакции между билирубином и диазотированной сульфаниловой кислотой образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 540 нм. Для определения общего билирубина необходима диссоциация неконъюгированного (непрямого, свободного) билирубина, что достигается введением в реакционную смесь кофеина. При определении содержания конъюгированного (прямого, связанного) билирубина кофеин из реакционной смеси исключается. Концентрация неконъюгированного билирубина рассчитывается по разнице концентрации между общим и конъюгированным билирубином.

Исследуемый материал:

Сыворотка крови. Гемолиз недопустим. Хранить в темноте

Состав набора и условия хранения:

1. Сульфаниловая кислота — 24 ммоль/л.
2. Нитрит натрия — 72 ммоль/л.
3. Кофеиновый реагент:
   • Кофеин — 240 ммоль/л;
   • Бензоат натрия — 250 ммоль/л.
4. Физиологический раствор.
5. Калибратор — 85,5 мкмоль/л.

Компоненты набора стабильны в течение 12 месяцев при хранении при температуре 18-25°С.

Дата изготовления, серия, номер по каталогу и срок годности указаны на упаковке набора.

Аналитические характеристики набора:

Приготовление калибратора:

Внести во флакон с калибратором 2,0 мл бидистиллированной воды. После полного растворения концентрация билирубина — 85,5 мкмоль/л. Данный раствор стабилен в течение 5 дней при температуре 2-8°С. Реагент светочувствителен. Хранить в темноте!

Приготовление диазореагента:

Смешать растворы сульфаниловой кислоты и нитрита натрия в соотношении 10 : 1. Диазореагент стабилен 10 дней при температуре 2-8°С в плотно закрытом флаконе в темноте.

Процедура анализа:

1. Определение содержания общего билирубина:

2. Определение содержания связанного билирубина:

Смешать и инкубировать при температуре 18-25 °С в течение 5 минут. Измерить оптическую плотность пробы (Епробы) и калибратора (Екалибратора) против соответствующих контролей на реактивы при λ = 540 (500-560) нм и d = 1 см.

Расчет:

Диагностическая информация:

­↑. Повреждение печеночных клеток, обтурация внутри и внепеченочных желчных протоков, гемолитические болезни, физиологическая желтуха новорожденных, синдром Криглера-Найяра, болезнь Жильбера, синдром Дабина-Джонсона, нарушение толерантности к фруктозе, синдром желтухи при грудном вскармливании, гипотиреоз, преходящая семейная гипербилирубинемия у детей.

­↓. Обтурация внутри и внепеченочных желчных протоков, повреждение печеночных клеток (особенно на поздних этапах болезни), синдром Дабина-Джонсона, синдром Ротора, холестаз.

­↑. Гемолитические состояния или те, которые связаны с разрушением гемоглобина, фаза выздоровления при остром гепатите или сепсисе, преходящая гипербилирубинемия новорожденных, синдром Криглера-Найяра, болезнь Жильбера.

источник

Лабораторная диагностика. Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфониевая кислота, которая реагирует со связанным билирубином и дает красное окрашивание. По интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он также вызывает красное окрашиваниераствора. По интенсивности последнего определяют концентрацию общего билирубина. Свободный билирубин равен разнице между общим и связанным.

Ход определения. В три пробирки (для определения уровня общего билирубина, связанной фракции и постановки контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме (табл.2.).

Данные для определения уровня билирубина в сыворотке крови

Колориметрируют пробы при зеленом светофильтре (500-560 нм); применяют кювету с шириной слоя 5 мм. Оценку результатов проводят по калибровочному графику, построенному в соответствии с инструкцией к наборам реагентов «Билирубин – эталон» фирмы «Лахема».

Находят содержание общего и связанного билирубина в мкмоль/л. Для определения уровня свободной фракции из цифр общего билирубина вычитают показатель конъюгированного.

В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л. 75% его количества приходится на долю свободной фракции.

Средние величины содержания в плазме общего, конъюгированного и свободного билирубина составляют соответственно 11,12; 2,57 и 8,56 мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение исследования

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9748 — | 7453 — или читать все.

источник

Билирубин и его фракции

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции

Принцип

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

Клинико‑диагностическое значение

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

источник

Работа № 1. Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека

Принцип метода. В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в растворе. Разрушение билирубин-альбуминового комплекса (свободный, или непрямой билирубин) осуществляется кофеиновым реактивом, который одновременно переводит билирубин в растворимое диссоциированное состояние. Интенсивность образующейся окраски измеряется на ФЭКе при зеленом светофильтре (563 нм), а количество билирубина определяется по калибровочному графику.

Ход работы.В 3 пробирки отмерить указанные в таблице реактивы и колориметрировать через 5 — 10 мин. на ФЭКе в кювете 10 мм против контроля при зеленом светофильтре.

По калибровочному графику определить содержание общего и связанного билирубина. Вычитая из уровня общего билирубина количество прямого, рассчитать содержание непрямого (свободного) билирубина. Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.

Нормальное содержание билирубина в крови –8,5 – 20,5 мкмоль/л; 75% общего билирубина составляет непрямой (свободный), 25% — прямой (связанный) билирубин.

Клинико-диагностическое значение определения содержания билирубина в сыворотке крови:определение общего билирубина и его фракций используется для диагностики и дифференциальной диагностики желтух различной этиологии – гемолитической (надпеченочной), паренхиматозной (гепатоцеллюлярной, печеночной) и обтурационной (механической, подпеченочной). При гемолитической желтухе гипербилирубинемия развивается в основном за счет непрямого (свободного) билирубина. При паренхиматозной желтухе происходит деструкция гепатоцитов и нарушается экскреция прямого билирубина в желчные ходы, он попадает в кровь. Кроме того из-за функциональной несостоятельности гепатоциты не способны эффективно захватывать из крови непрямой билирубин и конъюгировать его. При паренхиматзной желтухе наблюдается гипербилирубинемия смешанного типа. При обтурационной желтухе нарушается эвакуация желчи в двенадцатиперстную кишку, что приводит к повышению в крови прямого, а в более поздние сроки болезни и непрямого билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8703 — | 8256 — или читать все.

источник