Определение прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови

Определение общего, «прямого» и «непрямого» билирубина в сыворотке крови

Определение содержания билирубина в крови является важным диагностическим тестом. Билирубин обычно содержится в крови в небольших дозах (8-20 мкмоль/л), причем 75% из них составляет билирубин, связанный белками (нерастворимый) (5,7-15 мкмоль/л) и 25% «прямой» билирубин (2-5 мкмоль/л). При различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия, концентрация билирубина повышается.

Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окраски продукта взаимодействия билирубина с диазореактивом. Этот продукт окрашен в малиново-красный цвет. Билирубин-диглюкоуронид реагирует с диазосмесью непосредственно. Связанный с белками билирубин реагирует с диазосмесью после диссоциации белкового комплекса, которая достигается прибавлением к сыворотке кофеинового реактива.

Алгоритм определения

В три пробирки (для общего билирубина, «прямого» и для контроля) вводят реактивы согласно таблице:

Для определения «прямого» билирубина колориметрирование следует проводить спустя 5-10 минут после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает «непрямой» билирубин.

Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять на 20 минут, после чего колориметрируют.

При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.

Измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр), в кювете толщиной 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при колориметрировании общего и «прямого» билирубина, вычитают показатель контроля.

Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и «прямого» билирубина. Для определения уровня «непрямого» билирубина вычитают из показателя общего его содержания показатель «прямого» билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9748 — | 7453 — или читать все.

источник

Качественное определение «прямого» и «непрямого» билирубина в сыворотке крови

Билирубин образуется в организме в результате распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень, селезенка). Из тканей билирубин поступает в кровь, и как соединение токсичное захватывается печенью, где и обезвреживается путем соединения его с глюкуроновой кислотой, образуя моно- и диглюкурониды. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком.

В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый «непрямой» (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый «прямой» (диглюкуронид билирубина). Вместе обе формы составляют общий билирубин.

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая дает со связанным билирубином (хорошо растворимым в воде) розово-фиолетовое окрашивание, а «непрямой» билирубин, в присутствии спирта (спирт переводит «непрямой» билирубин в растворимое состояние) – красно-розовое.

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив (свежеприготовленный). 3. Этиловый спирт. 4. Фильтровальная бумага.

А) Обнаружение «прямого» билирубина. На часовое стекло, под которое подложен лист белой бумаги, наносят каплю сыворотки крови, содержащей «прямой» билирубин, добавляют 3 капли свежеприготовленного диазореактива и перемешивают стеклянной палочкой. Образуется характерное для билирубина розово-фиолетовое окрашивание.

Б) Обнаружение «непрямого» билирубина. В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови, 2 мл этилового спирта и фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива – появляется красно-розовое окрашивание.

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты и сделайте выводы.

Контрольные вопросы

1. Где и из чего в организме человека образуется билирубин?
2. Что означают термины «прямой» и «непрямой» билирубин?
3. Каким путем билирубин выделяется из организма человека?

Лабораторная работа №28

Количественное определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови

В крови билирубин содержится в небольших, но постоянных количествах: 8-20 мкмоль/л. В сыворотке крови содержатся две формы билирубина – связанный, или билирубинглюкуронид, хорошо растворимый в воде, и несвязанный, или свободный билирубин, плохо растворимый в воде. Свободная форма его циркулирует в крови в виде комплекса с альбумином. У здоровых людей 75% общего билирубина сыворотки крови составляет свободный билирубин.

В клинической практике чаще всего приходится встречаться с гипербилирубинемиями различного происхождения. Повышение уровня свободного билирубина в крови встречается при гемолитических желтухах, некоторых анемиях, желтухе новорожденных и др. Желтухи, связанные с затруднением оттока желчи (механические), сопровождаются повышением уровня глюкуронида билирубина («прямой»). При паренхиматозных желтухах наблюдается также повышение содержания глюкуронида билирубина, с преобладанием однако моноглюкуронида.

Принцип метода. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности окрашивания последнего фотометрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между содержанием общего и связанного билирубина находят количество свободного.

Исследуемый материал и реактивы

1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив I. 3. Диазореактив II. 4. Кофеиновый реактив. 5. Физиологический раствор хлорида натрия.

Перед работой готовят диазосмесь: смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II. В три пробирки (1 – для определения уровня общего билирубина, 2 – связанного билирубина и 3 – контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме:

При определении уровня общего билирубина пробу оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. В дальнейшем окраска пробы не изменяется. Для установления содержания коньюгированного (связанного) билирубина колориметрирование осуществляют спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии пробы в реакцию вступает свободный билирубин.

Колориметрируют опытные пробы против контроля при зеленом светофильтре (500–560 нм) в кювете шириной 5мм. Оценку результатов производят по калибровочному графику. В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л, 75% его количества приходится на долю свободного билирубина.

Калибровочный график для определения билирубина крови

Указания к оформлению лабораторной работы

В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований впишите нормальные значения концентрации билирубина в крови.

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты – концентрации общего и конъюгированного билирубина и сделайте выводы о причинах возможного отклонения этих показателей от нормы в исследуемом материале.

Контрольные вопросы

1. Назовите нормальную концентрацию билирубина в крови человека.
2. Перечислите причины гипербилирубинемии.
3. Для каких целей в клинике определяют количественное содержание билирубина в крови человека?

Лабораторная работа №29

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; Нарушение авторского права страницы

источник

Билирубин и его фракции

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции

Принцип

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

Клинико‑диагностическое значение

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

источник

Определение общего билирубина в сыворотке крови

(метод Иендрашика и Клеггорна)

Принцип метода. Билирубин образуется в организме в результате естественного распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень,селезенка). Билирубин относится к группе желчных пигментов и является токсическим веществом; он обезвреживается в клетках печени. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком. В печени происходит процесс обезвреживания по схеме:

билирубин + УДФ-глюкуроновая кислота билирубин (моно- и диглюкуроид)

Глюкурониды билирубина хорошо растворимы, они выводятся из печени по желчевыводящим путям.

В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый (диглюкуронид ). Вместе обе формы составляют общий билирубин.

Определение содержания билирубина в крови является важным диагностическим тестом. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах-0,5-1,2 мг/дл, причем 75% из них составляет билирубин, связанный с белками (нерастворимый).

При различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия, концентрация билирубина повышается до 30-35 мг/дл.

Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окраски продукта взаимодействия билирубина с диазореактивом. Этот продукт окрашен в малиново-красный цвет. Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно.

Связанный с белками билирубин реагирует с диазосмесью после диссоциации белкового комплекса, которая достигается прибавлением к сыворотке кофеинового реактива.

Ход определения. Готовят две пробирки (контрольную и опытную). Составляют реакционную смесь по схеме:

Диазосмесь готовят (в количестве, достаточном для всей учебной группы), смешивая 10 мл 0,5%-ного раствора сульфаниловой кислоты и 0,3 мл 0,5%-ного раствора нитрата натрия.

Содержимое опытной и контрольной проб хорошо перешивают, ставят на 20 минут в темноту, затем колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 500-560 нм) против контроля.

Если в пробах развивается слабая окраска, то перед колориметрированием в обе пробирки добавляют по 3 капли 30%-ного раствора NaOH. При этом цвет раствора переходит в зеленый, а при большей концентрации билирубина в синий, часто наблюдается исчезновение мути. Пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром. Расчет производят по калибровочному графику.

Калибровочный график для определения концентрации общего билирубина.

Оформление работы. В протокол вносят принцип метода, результаты колориметрии и расчет. Отмечают пределы колебаний концентрации билирубина в норме.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9748 — | 7453 — или читать все.

источник

Работа № 1. Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека

Принцип метода. В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в растворе. Разрушение билирубин-альбуминового комплекса (свободный, или непрямой билирубин) осуществляется кофеиновым реактивом, который одновременно переводит билирубин в растворимое диссоциированное состояние. Интенсивность образующейся окраски измеряется на ФЭКе при зеленом светофильтре (563 нм), а количество билирубина определяется по калибровочному графику.

Ход работы.В 3 пробирки отмерить указанные в таблице реактивы и колориметрировать через 5 — 10 мин. на ФЭКе в кювете 10 мм против контроля при зеленом светофильтре.

По калибровочному графику определить содержание общего и связанного билирубина. Вычитая из уровня общего билирубина количество прямого, рассчитать содержание непрямого (свободного) билирубина. Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.

Нормальное содержание билирубина в крови –8,5 – 20,5 мкмоль/л; 75% общего билирубина составляет непрямой (свободный), 25% — прямой (связанный) билирубин.

Клинико-диагностическое значение определения содержания билирубина в сыворотке крови:определение общего билирубина и его фракций используется для диагностики и дифференциальной диагностики желтух различной этиологии – гемолитической (надпеченочной), паренхиматозной (гепатоцеллюлярной, печеночной) и обтурационной (механической, подпеченочной). При гемолитической желтухе гипербилирубинемия развивается в основном за счет непрямого (свободного) билирубина. При паренхиматозной желтухе происходит деструкция гепатоцитов и нарушается экскреция прямого билирубина в желчные ходы, он попадает в кровь. Кроме того из-за функциональной несостоятельности гепатоциты не способны эффективно захватывать из крови непрямой билирубин и конъюгировать его. При паренхиматзной желтухе наблюдается гипербилирубинемия смешанного типа. При обтурационной желтухе нарушается эвакуация желчи в двенадцатиперстную кишку, что приводит к повышению в крови прямого, а в более поздние сроки болезни и непрямого билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Учись учиться, не учась! 10887 — | 8145 — или читать все.

источник