BioximiaForYou
Фибриноген – гликопротеид, растворимый предшественник нерастворимого фибрина.
Фибриноген синтезируется печенью в количестве 2-5 г в день, время его полувыведения из крови около 4-х дней.
Фибриноген относится к острофазным белкам, увеличивающийся в острой фазе воспаления. Повышение уровня фибриногена в острой фазе, как правило, имеет транзиторный характер в отличие от атеросклероза, при котором наблюдается устойчивое увеличение этого показателя, трудно поддающегося корреляции лекарственными препаратами.
Поскольку фибриногену принадлежит важная роль в системе свертывания крови, повышение его уровня при атеросклерозе принято рассматривать как один из патогенетических механизмов, обусловливающих повышенную свертываемость крови и нарушение регуляции тромбообразования, которое, в свою очередь, приводит к развитию инфаркта миокарда или инсульта.
Определение фибриногена в плазме крови часто используют не только при диагностике нарушений гемостаза, но и при распознавании и оценке тяжести воспалительных, иммунных и опухолевых процессах.
Гиперфибириногенемия – повышение уровня фибриногена в крови.
Является фактором повышенного риска развития артериальных тромбозов и инфарктов органов.
Физиологическое: беременность, менструация.
· Реакции острой фазы (лихорадка, инфекционные болезни, воспалительные и некротические процессы; травмы, ожоги, хирургические операции).
· Злокачественные опухоли (рак легкого)
· Болезни почек (острый и хронический пиелонефрит, гломерулонефрит; нефротический синдром)
Гипофибириногенемия – снижение концентрации уровня фибриногена в крови.
· Наследственный дефицит фибриногена (а- и гипофибриногенемия)
· ДВС-синдром (синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания)
· Состояние после кровотечения, травмы, ожога.
· Болезни печени (острая желтая атрофия печени, цирроз)
· Отравление гепатотропными ядами.
· Заболевания, сопровождающиеся поражением костного мозга (лейкозы)
· Лекарственные препараты (фенобарбитал)
Уменьшение содержание фибриногена плазмы до уровня ниже 1 г/л служит фактором риска появления кровотечений из сосудов внутренних органов.
Определение содержания фибриногена весовым (гравиметрическим) методом по Рутберг Р.А.
Принцип. Образовавшийся после свертывания плазмы крови фибрин быстро высушивается, и по весу определяют содержание фибриногена в плазме.
1. Хлорид кальция, 5% раствор;
2. Эмульсия тканевого тромбопластина на трис-буфере, 0,05 М (или буфере Михаэлиса), рН 7,3-7,4, для чего навеску сухого тромбопластина (50мг) тщательно растирают в 1,0 мл буфера. Постепенно объем смеси увеличивают добавлением буфера до 5,0 мл. Полученную эмульсию центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость отделяют и используют для анализа.. Эмульсия тромбопластина хранится при +2….+8 ° С в течение 3 суток.
Активность тромбопластина может быть в пределах 11 – 20 сек.
Материал для исследования: цитратная плазма.
К 1,0 мл плазмы в пробирке последовательно добавляют 0,1 мл эмульсии тромбопластина (или раствор тромбина) и 0,1 мл 5% р-ра хлорида кальция. Реагенты перемешивают стеклянной палочкой. Палочку оставляют в пробирке. Смесь инкубируют в термостате с прозрачными стенками (ТПС) или на водяной бане (37 ° С) 10 — 20 мин, после чего образовавшийся сгусток переносят на фильтровальную бумагу и высушивают путем сжатия и перемещения сгустка по бумаге. Такое высушивание продолжают до тех пор, пока на фильтре не перестанут определяться следы влаги в проходящем свете. Сгусток фибрина взвешивают на торсионных весах.
В норме масса сгустка фибрина составляет 9 – 18 мг.
Расчет : для определения концентрации фибриногена, выраженной в г/л, массу фибрина в мг умножают на коэффициент 0,222.
Фибриноген в г/л = мг фибрина ´ 0,222
источник
Определение содержания фибриногена в плазме крови по методу Рутберг.
Принцип. Образовавшийся в результате свертывания плазмы крови фибрин быстро высушивают и взвешивают. По его массе судят о количественном содержании фибриногена. Количество образовавшегося фибрина эквивалентно содержанию фибриногена в плазме.
Ход определения. К 1,0 мл плазмы добавляют 0,1 мл 0,45 моль/л раствора хлорида кальция. Ставят в ТПС при 37 °С на 10 мин. За этот период происходит образование сгустка. Далее сгусток переносят на обеззоленный бумажный фильтр и просушивают другим фильтром до сухого состояния, т. е. до тех пор, пока на фильтре не останется влажного пятна. Сгусток высушенного фибрина немедленно взвешивают на торсионных весах.
Норма. Масса сгустка составляет 9—15 мг.
Расчет. Для определения концентрации фибриногена, выраженной в г/л, массу сгустка фибрина умножают на экспериментально установленный коэффициент 0,222.
Примечание. Для ускорения превращения фибриногена в фибрин и более полного образования сгустка в реакционную смесь вносят 0,2 мл раствора тромбопластина, который используется в методике определения протромбинового времени.
Клинико-диагностическое значение. Гиперфибриногенемия (повышенное содержание фибриногена) отмечается при острых воспалительных и некробиотических процессах (перитоните, сепсисе, гломерулонефрите, пневмонии, туберкулезе легких, ревматизме, злокачественных опухолях, инфаркте миокарда, наклонности крови к гиперкоагуляции и тромбозам). Гипофибриногенемия (сниженное содержание фибриногена) наблюдается при врожденных афибриногенемиях, гипофибри-ногенемиях, приобретенных нарушениях синтеза фибриногена (хронический гепатит, цирроз печени, эритремия, ДВС-син-дром), усиленном фибринолизе и фибриногенолизе. Снижение уровня фибриногена может наблюдаться при оперативных вмешательствах на легких, поджелудочной и щитовидной железах, матке, преждевременной отслойке плаценты, при шоковых состояниях. Уменьшение содержания фибриногена плазмы ниже 1 г/л вызывает кровоточивость. Гипофибриногенемию могут вызвать препараты, используемые для активации фибринолиза (стрептаза, урокиназа и др.).
Определение естественного (спонтанного) лизиса и ретракции фибринового сгустка.
Принцип. При сокращении (ретракции, Р) и растворении фибринового сгустка (спонтанного фибринолиза, СФ) выделяется сыворотка, а форменные элементы выпадают в осадок. Зная гематокрит (соотношение объема эритроцитов и плазмы крови) исследуемой крови и количество форменных элементов, выпавших из сгустка, рассчитывают СФ и Р в процентах.
Ход определения. В сухую центрифужную градуированную пробирку набирают 2 мл крови из вены и немедленно погружают в нее якорь (крючок из нержавеющей стали либо специальная стеклянная палочка). Пробирку помещают в термостат при 37 °С на 2 ч, затем вынимают из термостата, осторожно удаляют прикрепившийся к якорьку сгусток а пробирку центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин для осаждения форменных элементов крови, выпавших в результате лизиса сгустка. Определяют, какой объем (мл) в пробирке занимают сыворотка (F 2) и эритроциты (F 3). Спонтанный фибринолиз и ретракцию рассчитывают по следующим формулам:
где: F 2 — объем сыворотки (мл) в 2 мл взятой крови; Vпл — объем плазмы, высчитанный по гематокриту (Vпл = 1 — гематокрит); 50 — расчет на 100 мл плазмы. Норма составляет 60—80%.
где: F 3 — объем форменных элементов (мл) в 2 мл крови; гематокрит — объем эритроцитов; 50 — расчет на 100 мл плазмы. Норма. 10—20%.
Клинико-диагностическое значение. Степень ретракции кровяного сгустка является показателем количества и функционального состояния тромбоцитов. Недостаточная ретракция наблюдается при выраженных тромбоцитопениях, некоторых видах качественной неполноценности тромбоцитов, избытке эритроцитов (эритроцитозы). Ложно завышенная ретракция наблюдается при анемиях и снижении гематокрита, а также при гипофибриногенемиях. Увеличение процесса лизиса фибринового сгустка свидетельствует об активности, а уменьшение о торможении фибринолитической (плазминовой) системы крови. Активация ФАК наблюдается у больных в послеоперационном периоде, особенно при операциях на матке, легких, поджелудочной железе, предстательной железе, ожогах, шоковых состояниях, циррозах печени, злокачественных опухолях, действии ионизирующего излучения и др. Торможение ФАК является показателем риска тромбообразования. Снижается фибринолиз при атеросклерозе, гипертонической болезни, инфаркте миокарда, тромбоэмболических осложнениях и др.
источник
Определение концентрации фибриногена
Определение концентрации фибриногена в клинической практике проводят для оценки системы гемостаза, острофазного ответа и риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Референтный диапазон его концентрации составляет 2,0-4,0 г/л и практически не зависит от пола и возраста, а при тяжелых бактериальных инфекциях, травмах его концентрация может превышать 10 г/л.
Для количественного определения концентрации фибриногена в условиях клинико-диагностических лабораторий наиболее применим метод Клаусса в основе которого лежит логарифмическая зависимость концентрации фибриногена в разведенной исследуемой плазме от lg времени образования сгустка после добавления к плазме тромбина высокой активности.
Перед регистрацией времени образования фибринового сгустка исследуемую плазму первоначально разводят буферным раствором в 10 раз, поскольку только в условиях высокой активности тромбина и низких концентраций фибриногена наблюдается линейная зависимость концентрации от времени образования фибрина. Такое разведение плазмы крови позволяет определять концентрацию фибриногена ориентировочно в диапазоне до 5,0 г/л. Этап разведения образца плазмы может отрицательно влиять на воспроизводимость метода.
Исключение этапа предварительного разведения пробы представляется целесообразным с позиции контроля качества исследований, и реализовано в модифицированном методе Клаусса используемого новой тест-системой «МультиТех-Фибриноген» производства фирмы « Технология –Стандарт». Модифицированный метод Клаусса позволяет исследовать концентрацию фибриногена в более широком диапазоне и исключить влияние этапа разведения пробы на правильность и воспроизводимость.
Метод может быть применен для определения концентрации фибриногена на коагулометрах с оптическим, оптико-механическим и механическим принципом регистрации образования сгустка.
Ниже приводятся результаты апробации и сравнения новой тест-системы с наборами реагентов для определения концентрации фибриногена других производителей.
Принцип метода заключается в определении времени свертывания цитратной плазмы избытком тромбина. Концентрация фибриногена определяется по калибровочной кривой, построенной в билогарифмической системе координат.
Подготовка реагентов к работе и проведение исследования приведены в инструкции к набору реагентов «МультиТех-Фибриноген».
Оценка результатов: Время свертывания исследуемого образца плазмы составляет 5-100 с, в зависимости от концентрации фибриногена и типа коагулометра. Диапазон определения концентрации фибриногена без дополнительного разведения составляет 0,9-10,0 г/л. Если результаты определения близки к 0,9 г/л или меньше (отсутствие регистрации сгустка), концентрацию фибриногена следует определить классическим методом Clauss набором реагентов «Тех-фибриноген-тест» (кат. № 094 или кат. № 324) или аналогичным с разведением плазмы 1:5. Концентрация фибриногена у здоровых людей находится в диапазоне от 2,0 до 4,0 г/л.
Результаты сравнительного тестирования набора реагентов «МультиТех-Фибриноген» с близкими по назначению наборами и различных коагулометрах
Калибровка тест-системы «МультиТех-Фибриноген» выполнена на коагулометрах с разным принципом регистрации времени образования сгустка с использованием набора «МультиТех-Калибратор», состоящего из 5 лиофилизированных образцов калибровочных плазм с концентрацией фибриногена 1.25, 2.2, 3.2, 5.5, 8.0 г/л. Калибровочные кривые, построенные для разных приборов, представлены на рис. Зависимость концентрации фибриногена от времени образования сгустка в билогарифмической системе координат приближается к прямой линии на всей области тестирования.
Рис. Калибровочные кривые, полученные при использовании набора «МультиТех-Фибриноген» на разных коагулометрах
Сравнение разных тест-систем проведено с использованием контрольной плазмы с концентрациями фибриногена 0,6; 1, 1; 2,3; 3,4; 5,6; 8,4 г/л . В таблице 1 приведены данные по стабильности определения КФ в плазме крови наборами реагентов разных фирм при проведении исследования по методу Клаусса с предварительным разведением плазмы 1:10, и использовании цельной плазмы, при проведении исследования по модифицированному методу.
ВАЖНО! Применение модифицированного метода Клаусса позволяет расширить диапазон уверенного определения КФ для разных типов коагулометров, особенно в области высоких концентраций, требующих дополнительного разведения пробы при классическом варианте метода.
Таблица 1.
Результаты определения КФ тест-системами разных производителей
источник
Определение концентрации фибриногена в клинико-диагностической лаборатории
1 Определение концентрации фибриногена в клинико-диагностической лаборатории Бирюля Диана Геннадьевна ООО фирма «Технология-Стандарт»
2 Фибриноген гликопротеин плазмы крови синтезируется в печени в количестве 2-5 г в день, время его полувыведения около 4-х дней Функции: образование фибринового сгустка, заживление ран, фибринолиз, воспаление, ангиогенез, клеточное и структурное взаимодействие, неоплазия Референтные значения 2,0-4,0 г /л концентрация может увеличиться на % во время физиологического стресса
3 сложный гликопротеин, состоящий из трех пар полипептидов:α,β и ϒ полипептиды связаны друг с другом 29 дисульфидными связями
4 Клинико-диагностическое значение Гиперфибриногенемия повышение уровня фибриногена в крови. Является фактором повышенного риска развития артериальных тромбозов и инфарктов органов. Физиологическое: холодное время года, беременность, менструация, постменопауза Патологическое повышение: Реакции острой фазы (лихорадка, инфекционные болезни, воспалительные и некротические процессы; травмы, ожоги, хирургические операции). Злокачественные опухоли, метастазирование Курение Оральные контрацептивы
5 Клинико-диагностическое значение Гипофибриногенемия снижение концентрации уровня фибриногена в крови. Наследственный дефицит фибриногена (а- и дисфибриногенемия) ДВС-синдром (синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания) Гемодилюция кровезаменителями Декомпенсированные болезни печени (вирусные гепатиты, цирроз) Уменьшение содержание фибриногена плазмы до уровня ниже 1 г/л служит фактором риска появления кровотечений из сосудов внутренних органов
6 Историческая справка R. Wirchow в 1847 году предположил, что существует некий растворимый предшественник в плазме, из которого и формируется кровяной сгусток в 1859 году Deni de Commercy впервые предложил для этого предшественника термин «фибриноген» в 1876 году выделен Олафом Хаммарстен (Швеция) из плазмы лошадей В 1904 году А. Шмидт наряду с тромбином определил центральную роль F I в коагуляционном каскаде В 1909 году, фибриноген впервые был выделен в хорошо очищенном виде
7 Методы определения концентрации фибриногена в крови Нефункциональные методы: высаливания или тепловой преципитации фибриногена с последующим количественным исследованием коагулята (объемным методом, фотометрией) образование стабильного фибрина с последующим выделением и взвешиванием фотометрическое определение после растворения фибрина при помощи биуретового реактива иммунологический метод Функциональные методы определение по Клауссу с тромбином турбидиметрическая модификация c батроксобином
8 Данный этап практически невозможно сделать стандартным. Сильное отжимание сгустка — приводит к потерям фибрина Слабое отжимание — к ложному завышению уровня фибриногена Определение содержания весовым (гравиметрическим) методом по Рутберг Р.А. Принцип. Образовавшийся после свертывания плазмы крови фибрин быстро высушивается, и по весу определяют содержание фибриногена в плазме. Реактивы:1. Хлорид кальция, 5% раствор; 2. Эмульсия тканевого тромбопластина на трис-буфере, 0,05 М (или буфере Михаэлиса), рн 7,3-7,4 Материал для исследования: цитратная плазма. Ход определения: К 1,0 мл плазмы в пробирке последовательно добавляют 0,1 мл эмульсии тромбопластина (или раствор тромбина) и 0,1 мл 5% р-ра хлорида кальция. Реагенты перемешивают стеклянной палочкой. Палочку оставляют в пробирке. Смесь инкубируют в термостате с прозрачными стенками (ТПС) или на водяной бане (37 С) мин, после чего образовавшийся сгусток переносят на фильтровальную бумагу и высушивают путем сжатия и перемещения сгустка по бумаге. Сгусток фибрина взвешивают на торсионных весах. В норме масса сгустка фибрина составляет 9 18 мг. Расчет: для определения концентрации фибриногена, выраженной в г/л, массу фибрина в мг умножают на коэффициент 0,222. Фибриноген в г/л = мг фибрина 0,222 Норма в плазме: 2 4 г/л Сгусток может быть рыхлым вследствие наличия ингибиторов тромбообразования Большой объем используемой плазмы ограничивает использование в педиатрии Экономичен Данный этап практически невозможно стандартизировать! Сильное отжимание — приводит к потерям фибрина Слабое отжимание — к ложному завышению уровня фибриногена Максимальный контакт персонала с кровью
9 Иммунологические методы определения концентрации фибриногена и электрофрез иммуноферментный анализ (ELISA) радиальная иммунодиффузия иммунонефелометрии электрофорез Измерение концентрации белка, а не его функциональной активности Занимает много времени Ложные результаты при наличии ПДФ Использование моноклональных антител к разным антигенам фибриногена позволяет выявлять функциональные формы Рекомендован к использованию для оценки риска кардиоваскулярных заболеваний Fibrinogen antigen measurement is suitable for studies assessing fibrinogen as a risk factor for cardiovascular disease (Cremer et al, 1994; Sweetnam et al, 1996, 1998)
10 Определение концентрации фибриногена в протромбиновом тесте (PT derived Fibrinogen) Анализатор калибруется при исследовании протромбинового время плазмы (или серии разведений плазмы) с известной концентрацией фибриногена и построения графиков изменения оптической плотности по отношению к концентрации фибриногена в логарифмических шкалах Применение PT-Fg метода обеспечивает быстрое измерение фибриногена без каких-либо дополнительных затрат Метод применим только на автоматических анализаторах Результаты зависят от метода калибровки, типа анализатора и реагентов, и оптической прозрачности пробы Не рекомендован к применению у больных с ДВС, заболевания печени, заболевания почек, дисфибриногенемией, с высоким или низким уровнем фибриногена получавших антикоагулянты, тромболитической терапией Guidelines on fibrinogen assays British Journal of Haematology, 2003, 121, Корреляция с методом Clauss нелинейная (сигмовидная)
11 Метод Сlauss Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, 17, К плазме крови добавляют тромбин высокой активности и измеряют время образования сгустка. Расчет концентрации фибриногена проводят по калибровочной кривой построенной в логарифмических шкалах. Для исследования используют плазму крови разведенную буфером в 10 раз. Диапазон значений при стандартном разведении плазмы от 1 до 5 г/л Выполняется на коагулометрах с механическим и оптическим типом детекции образования сгустка Метод рекомендован для разных групп пациентов Построение калибровочных кривых позволяет адаптировать любой прибор к набору реагентов Дополнительные разведения образца необходимы если превышен диапазон линейности Малочувствителен к гепарину в терапевтических дозах и ПДФ Исследование может быть выполнено на коагулометре с любым вариантом регистрации образования сгустка
12 Классический метод Clauss ПЛАЗМА КРОВИ + БУФЕР ПЛАЗМА разведение 1:9 этап предварительного разведения плазмы ТРОМБИН Диапазон линейности метода от 1 до 5 г/л фибриногена Время образования сгустка от 4 сек иследование только на коагулометре
13 Модифицированный метод Clauss Нет этапа предварительного разведения плазмы ПЛАЗМА ТРОМБИН Диапазон линейности метода от 1 до 10 г/л фибриногена
14 Наборы реагентов модифицированного метода CLAUSS в России Барнаул
15 Калибровка 100 Время, сек 10 STart-4 CoaData KC 4D АПГ Концентрация фибриногена, г/л
источник