Приготовление реактивов для определения билирубина

Унифицированный метод определения билирубина по диазореакции (метод Ендрассика-Грофа)

Принцип метода: Под воздействием НСI разрывается связь билирубина и образуется два дипиррола, которые диазотируются диазобензо сульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 125 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до 50-60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят водой до 100 мл.

5. Натрия хлорид: 154 ммоль/л (изотонический раствор: 0,9 г хлорида натрия в 100 мл воды.

8. Диазосмесь. Диазореактив 1: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300-400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСI, раствор доливают до 1 л. Диазореактив 2: натрия нитрит 5г/л: 0,5 г нитрита натрия в 100 мл воды. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива 1 и 0,3 мл диазореактива 2.

9. Билирубин для построения калибровочного графика 800 мг/л.

10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного Na₂СО₃ растворяют и доводят до 1 л водой.

11. Уксусная кислота, 4 моль/л; 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл водой.

Ход определения: В три пробирки: две опытные и одну холостую вносят реактивы: по 0,5 мл сыворотки крови, кофеиновый реактив вносят в первую опытную пробирку для определения общего билирубина и в холостую пробу по 1,75 мл, во вторую опытную не вносят. Затем во вторую опытную (это определение связанного билирубина) прибавляют 1,75 мл и в холостую пробу 0,25 мл раствора хлорида натрия. Вносят диазосмесь в первую и во вторую опытные пробирки по 0,25 мл.

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5-10 минут после добавления диазосмеси, при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 минут, после чего измеряют на ФЭК при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику.

Основной раствор билирубина: в колбе на 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30-35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na₂СО₃ и несколько раз перемешивают, доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором карбоната натрия.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. Этот раствор содержит на 100 мг/л билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Для ее приготовления смешивают 13,9 мл той же сыворотки, 2мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 минут.

Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным: в 5 пробирок прибавляют 0,05 мл; 0,1 мл; 0,15 мл; 0,2 мл; 0,25 мл рабочего раствора билирубина, добавляют с первой по пятую: 0,45 мл; 0,4 мл; 0,35 мл; 0,3 мл; 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия. В пробах количество билирубина соответствует с первой по пятую пробирки: 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025 мг. Концентрация билирубина в сыворотке крови: 17,1 мкмоль/л; 34,2 мкмоль/л; 51,3 мкмоль/л; 68,4 мкмоль/л; 85,5 мкмоль/л.

Нормальные величины. В сыворотке крови содержится 8,5-20,5 мкмоль/л общего билирубина, из которого 75% приходится на долю свободного билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Увлечёшься девушкой-вырастут хвосты, займёшься учебой-вырастут рога 10199 — | 7908 — или читать все.

источник

Инструкция по применению Набора реагентов для количественного определения содержания общего билирубина в сыворотке или плазме крови человека «Общий билирубин — UTS»

по применению Набора реагентов для количественного определения содержания общего билирубина в сыворотке или плазме крови человека

Набор реагентов «ОБЩИЙ БИЛИРУБИН — UTS» разрешен к производству, продаже и применению на территории РФ.

Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05453

Информация для заказа набора «ОБЩИЙ БИЛИРУБИН — UTS»

Р1 80 мл + Р2 20 мл + калибратор

Р1 320 мл + Р2 80 мл + калибратор

где v – объем фотометрической ячейки анализатора.

ВНИМАНИЕ! Изменено соотношение компонентов набора. Рабочий реагент готовить смешиванием Реагента 1 (Р1) и Реагента 2 (Р2) в соотношении (4 : 1).

1. НАЗНАЧЕНИЕ

1.1. Набор реагентов «ОБЩИЙ БИЛИРУБИН — UTS» предназначен для определения содержания общего билирубина в сыворотке или плазме крови человека в клинико-диагностических и биохимических лабораториях для целей диагностики заболеваний и контроля проводимого лечения пациентов.

1.2. Билирубин является продуктом распада гемоглобина и присутствует в свободной и прямой (конъюгированной) формах в организме человека. При распаде гемоглобина первоначально образуется гидрофобный (нерастворим в воде), липофильный (жирорастворимый, токсичный) свободный билирубин, в плазме крови он присутствует в основном в комплексе «альбумин-билирубин». Далее комплекс «альбумин-билирубин» транспортируется в печень, в клетках которой свободный билирубин ферментативно связывается с глюкуроновой кислотой. В результате этого процесса (конъюгации) образуется конъюгированный (прямой) билирубин (водорастворимый и менее токсичный), который активно против градиента концентрации экскретируется в желчные ходы и в составе желчи поступает в кишечник. В норме в крови человека 75% общего билирубина приходится на долю свободного билирубина и 25% на долю прямого (связанного) билирубина.

1.3. Увеличение содержания билирубина в крови может обуславливаться многими причинами: увеличение интенсивности гемолиза эритроцитов; поражение паренхимы печени с нарушением ее билирубинвыделительной функции; нарушение оттока желчи из желчных путей в кишечник. На этом основано клиническое значение анализа [1].

1.4. Потенциальный риск применения набора – класс 2а. Основной риск косвенный и связан с возможностью получения неверного результата анализа, что может привести к неправильно поставленному диагнозу и назначению неэффективного лечения пациента. Для снижения указанного риска необходимо в каждой аналитической серии контролировать качество результатов анализов с применением контрольных сывороток в соответствии с ОСТ 91500.13..

2. ПРИНЦИП МЕТОДА

2.1. Определение общего билирубина (свободного и прямого) основано на реакции диазотирования билирубина диазосульфаниловой кислотой, в результате чего образуется соединение азобилирубин розового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации билирубина в пробе и измеряется спектрофотометрически при нм [2,3,4]. Прямой билирубин взаимодействует с диазосульфаниловой кислотой в водной среде, в то время как свободный билирубин необходимо перевести в водорастворимую форму с помощью диметилсульфоксида.

2.2. Фотометрическое измерение основано на наличии пика поглощения с максимумом при длине волны 540 нм молекулами окрашенного азобилирубина. Все остальные компоненты реакционной смеси слабо поглощают свет при этой длине волны. Таким образом, увеличение оптической плотности реакционной смеси пропорционально интенсивности окраски азобилирубина и, следовательно, прямо пропорционально концентрации общего билирубина в исследуемом образце.

3. СОСТАВ НАБОРА

3.1. Набор реагентов «ОБЩИЙ БИЛИРУБИН-UTS» поставляется в виде двух растворов Р1, Р2 и лиофилизированного калибратора.

источник

Билирубин по Йендрашику (Серия 300)

Только для IN VITRO диагностики!

• Кат.№ 326.1.400 — 400 определений (при конечном объеме 2 мл)

Принцип метода:

В результате реакции между билирубином и диазотированной сульфаниловой кислотой образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 540 нм. Для определения общего билирубина необходима диссоциация неконъюгированного (непрямого, свободного) билирубина, что достигается введением в реакционную смесь кофеина. При определении содержания конъюгированного (прямого, связанного) билирубина кофеин из реакционной смеси исключается. Концентрация неконъюгированного билирубина рассчитывается по разнице концентрации между общим и конъюгированным билирубином.

Исследуемый материал:

Сыворотка крови. Гемолиз недопустим. Хранить в темноте

Состав набора и условия хранения:

1. Сульфаниловая кислота — 24 ммоль/л.
2. Нитрит натрия — 72 ммоль/л.
3. Кофеиновый реагент:
   • Кофеин — 240 ммоль/л;
   • Бензоат натрия — 250 ммоль/л.
4. Физиологический раствор.
5. Калибратор — 85,5 мкмоль/л.

Компоненты набора стабильны в течение 12 месяцев при хранении при температуре 18-25°С.

Дата изготовления, серия, номер по каталогу и срок годности указаны на упаковке набора.

Аналитические характеристики набора:

Приготовление калибратора:

Внести во флакон с калибратором 2,0 мл бидистиллированной воды. После полного растворения концентрация билирубина — 85,5 мкмоль/л. Данный раствор стабилен в течение 5 дней при температуре 2-8°С. Реагент светочувствителен. Хранить в темноте!

Приготовление диазореагента:

Смешать растворы сульфаниловой кислоты и нитрита натрия в соотношении 10 : 1. Диазореагент стабилен 10 дней при температуре 2-8°С в плотно закрытом флаконе в темноте.

Процедура анализа:

1. Определение содержания общего билирубина:

2. Определение содержания связанного билирубина:

Смешать и инкубировать при температуре 18-25 °С в течение 5 минут. Измерить оптическую плотность пробы (Епробы) и калибратора (Екалибратора) против соответствующих контролей на реактивы при λ = 540 (500-560) нм и d = 1 см.

Расчет:

Диагностическая информация:

­↑. Повреждение печеночных клеток, обтурация внутри и внепеченочных желчных протоков, гемолитические болезни, физиологическая желтуха новорожденных, синдром Криглера-Найяра, болезнь Жильбера, синдром Дабина-Джонсона, нарушение толерантности к фруктозе, синдром желтухи при грудном вскармливании, гипотиреоз, преходящая семейная гипербилирубинемия у детей.

­↓. Обтурация внутри и внепеченочных желчных протоков, повреждение печеночных клеток (особенно на поздних этапах болезни), синдром Дабина-Джонсона, синдром Ротора, холестаз.

­↑. Гемолитические состояния или те, которые связаны с разрушением гемоглобина, фаза выздоровления при остром гепатите или сепсисе, преходящая гипербилирубинемия новорожденных, синдром Криглера-Найяра, болезнь Жильбера.

источник

БИЛИРУБИН ОБЩИЙ fast 100 АГАТ

ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для определения
общего билирубина в сыворотке крови
модифицированным методом Ендрашика-Грофа

НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для количественного колориметрического определения концентрации билирубина в сыворотке крови человека модифицированным методом Ендрашика-Грофа в клинико-диагностических и биохимических лабораториях и научно-исследовательской практике.

Набор рассчитан на проведение 100 определений при расходе 1,0 мл рабочего раствора на один анализ, включая холостые пробы.

ПРИНЦИП МЕТОДА
Билирубины, прямой (коньюгирован с глюкоронатом) и непрямой (неконьюгированый, связанный с альбумином), в присутствии кофеина и детергента, соединяются с диазотированной сульфаниловой кислотой. Образуется азосоединение, окрашенное в красный цвет, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации билирубина в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 546 нм.

Термины «прямой» и «общий» относятся к реакционным характеристикам сывороточного билирубина в отсутствии или присутствии растворяющего (ускоряющего) реагента (акселератора), которые только приблизительно являются эквивалентами коньюгированной и неконьюгированной фракций билирубина.

СОСТАВ НАБОРА
1. АТ реактив, (сульфаниловая кислота – 14 ммоль/л, соляная кислота – 100 ммоль/л, кофеин – 200 ммоль/л, бензоат натрия – 420 ммоль/л, детергент Brij 35–35 г/л), 100 мл – 2 флакона;
2. ВТ реактив (нитрит натрия – 310 ммоль/л), 10 мл – 1 флакон;
3. Калибратор (лиофильно высушенный раствор билирубина в альбумине с концентрацией в интервале 100–130 мкмоль/л), 2 мл – 1 флакон.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Линейная область определения концентрации билирубина: 8–452 мкмоль/л, отклонение от линейности – не более 8%.
Чувствительность определения: не более 3 мкмоль/л.
Воспроизводимость: коэффициент вариации – не более 8%.

Нормальные величины концентрации общего билирубина в сыворотке крови составляют:
– для взрослых: до 8,5–20,5 мкмоль/л;
– при рождении: до 85,5 мкмоль/л;
– для новорожденных (5 дней): до 205 мкмоль/л;
– для новорожденных (1 месяц): до 25,6 мкмоль/л.

Качество набора можно оценивать по контрольным сывороткам отечественного или зарубежного производства, аттестованным данным методом. Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон нормальных величин у обследуемого контингента.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
АТ реактив содержит едкие вещества. В случае попадания раствора на кожу и (или) слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством воды. Пипетирование per os категорически запрещается. Другие компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. При работе с сывороткой или плазмой крови необходимо соблюдать правила техники безопасности принятые в лаборатории, т.к. образцы человеческой крови следует рассматривать как потенциально инфицированые.

ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
– Анализатор, спектрофотометр, или фотометр, длина волны волны 546 нм или светофильтр в диапазоне 520–560 нм;
– пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,1 и 1,0 мл;
– пробирки центрифужные или флаконы вместимостью 5–10 мл;
– секундомер;
– вода дистиллированная;
– перчатки резиновые или пластиковые.

АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Свежая негемолизированная сыворотка крови, свежая плазма стабилизированная ЭДТА или гепарином. Билирубин стабилен в течение 3-х дней при хранении при +2–8° С при хранении образца в защищенном от света месте.

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
АТ и ВТ реактивы. Растворы готовы к применению.
Калибратор. Аккуратно вскрыть флакон с лиофилизатом. Добавить точно 2,0 мл дистиллированной воды. Перемешать, не допуская вспенивания. Через 10 минут калибратор готов к применению. Точная концентрация указана на флаконе.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Компоненты реакционной смеси внести в пробирки в количествах, указанных в таблице:

Содержимое пробирок тщательно перемешать и инкубировать при температуре +18–25° С в течение 10–30 минут *. Измерения проводить при длине волны 546 (520–560) нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Измерить величину оптической плотности калибровочной Ек и опытных проб Еоп против соответствующих холостых проб. Окраска устойчива в течение 1,5 часов после окончания инкубации.

Определить по калибратору билирубина фактор (F) по формуле:

где: Ск – концентрация билирубина в калибраторе (указана на флаконе), мкмоль/л;
Eк – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.
Содержание общего билирубина определить по формуле:

где: Eоп – оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.
F – фактор пересчета оптической плотности в мкмоль/л.

Примечание: При проведении большого количества анализов для удобства работы можно смешать реактивы АТ и ВТ в соотношении 20:1 и полученный рабочий раствор использовать в течение 8 часов.

* Допускается использование термостатируемой кюветы, т.е. проведение анализа при +37° С.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение наборов при температуре до +25° С не более 5 суток.
АТ и ВТ реактивы после вскрытия флаконов могут храниться в укупоренном виде при температуре +2–25° С в течение всего срока годности набора.

Калибратор во флаконе может храниться в укупоренном виде в течение 8 часов при +25° С, 3-х суток при +2–8° С, или 2 недели при –20° С после разведения. Хранить в темном месте!

При концентрации билирубина выше, чем 452 мкмоль/л, исследуемый образец необходимо развести раствором натрия хлористого 9 г/л в соотношении 1:1, повторить анализ, полученный результат умножить на 2.

Срок хранения 2 года при +2–8° С.
Инструкция по применению набора под биохимические анализаторы высылается по запросу.

По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат–Мед». Телефон для справок: (495) 777-41-92.

Инструкция составлена: В.В. Гладуном – главным технологом ООО «Агат-Мед», И.В. Тишкиной – научным сотрудником ООО «Агат-мед», И.В. Смирновым – зав. лабораторией ГНЦ РАМН.

Контрольная сыворотка Биоконт-С

Контрольная сыворотка Биоконт-С

Масло иммерсионное для микроскопии

Стабилизированный концентрированный раствор гемоглобина и контрольные материалы на его основе

источник