Работа № 1. Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека
Принцип метода. В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в растворе. Разрушение билирубин-альбуминового комплекса (свободный, или непрямой билирубин) осуществляется кофеиновым реактивом, который одновременно переводит билирубин в растворимое диссоциированное состояние. Интенсивность образующейся окраски измеряется на ФЭКе при зеленом светофильтре (563 нм), а количество билирубина определяется по калибровочному графику.
Ход работы.В 3 пробирки отмерить указанные в таблице реактивы и колориметрировать через 5 — 10 мин. на ФЭКе в кювете 10 мм против контроля при зеленом светофильтре.
По калибровочному графику определить содержание общего и связанного билирубина. Вычитая из уровня общего билирубина количество прямого, рассчитать содержание непрямого (свободного) билирубина. Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.
| Реактивы | Пробирки | ||
| 1-я | 2-я | 3-я | |
| Сыворотка крови | 1 мл | 1 мл | 1 мл |
| Кофеиновый реактив | 3,5 мл | 3,5 мл | — |
| Диазореактив | 0,5 мл | — | 0,5 мл |
| Физиологический раствор | — | 0,5 мл | 3,5 мл |
| Типы билирубина | общий | контроль | прямой (связанный) |
Нормальное содержание билирубина в крови –8,5 – 20,5 мкмоль/л; 75% общего билирубина составляет непрямой (свободный), 25% — прямой (связанный) билирубин.
Клинико-диагностическое значение определения содержания билирубина в сыворотке крови:определение общего билирубина и его фракций используется для диагностики и дифференциальной диагностики желтух различной этиологии – гемолитической (надпеченочной), паренхиматозной (гепатоцеллюлярной, печеночной) и обтурационной (механической, подпеченочной). При гемолитической желтухе гипербилирубинемия развивается в основном за счет непрямого (свободного) билирубина. При паренхиматозной желтухе происходит деструкция гепатоцитов и нарушается экскреция прямого билирубина в желчные ходы, он попадает в кровь. Кроме того из-за функциональной несостоятельности гепатоциты не способны эффективно захватывать из крови непрямой билирубин и конъюгировать его. При паренхиматзной желтухе наблюдается гипербилирубинемия смешанного типа. При обтурационной желтухе нарушается эвакуация желчи в двенадцатиперстную кишку, что приводит к повышению в крови прямого, а в более поздние сроки болезни и непрямого билирубина.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Сдача сессии и защита диплома — страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 9111 — 
| 7345 — 
или читать все.
источник
Лабораторная работа № 14 Количественное определение общего билирубина в сыворотке крови по методу Ендрассика и Клехгорна.
Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина в сыворотке крови.
Мотивация: Билирубин продукт ферментативного окисления гемоглобина (конечный продукт распада гема), образующийся в результате естественного распада эритроцитов в клетках РЭС, относится к группе желчных пигментов. Билирубин вещество токсичное, т.к. молекула билирубина является гидрофобной и может проникать в клетки головного мозга. Поэтому в организме человека существуют реакция обезвреживания билирубина, которая протекает в печени.
где УФДГК кофермент уридиндифосфат глюкуроновая кислота, УДФГТ фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.
Билирубиндиглюкуронид экскретируется с желчью в ЖКТ, где высвобождается из коньюгата, восстанавливается до уробилиногена, затем превращается в стеркобилиноген, в форме которого и выводится из организма человека.
Принцип метода: в основе определения билирубина лежит реакция азосочетания билирубина с диазосмесью Эрлиха, в результате которой появляется малиновокрасная окраска за счет образующегося азобилирубина. Концентрация последнего определяется фотоколориметрически.
Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно (прямой билирубин по старой терминологии), тогда как свободный билирубин неустойчив в растворе в сильно кислой среде, при которой происходит реакция азосочетания и требует присутствия стабилизатора, роль которого могут играть кофеин, спирт, мочевина, ацетат, бензонат натрия и др. (непрямой билирубин).
1. Химические пробирки, бюретки, пипетки на 10мл и 1 мл; 2. Раствор сульфаниловой кислоты 0,5%; 3. Раствор нитрита натрия 0,5% (готовится еженедельно); 4. Кофеиновый реактив: кофеина чистого 5г, бензойнокислого натрия – 37,5г, уксуснокислого натрия – 62,5г, растворяются при нагревании: раствор доводится дистиллированной водой до 1л; 5. Сыворотки крови с различными концентрациями билирубина.
Ход работы: в химическую пробирку из бюреток отмеривают 1 мл сыворотки и 2,5 мл кофеинового реактива. Диазосмесь готовят в одной пробирке на всю группу следующим образом: 10 мл 0,5% раствора сульфаниловой кислоты и 0,25мл 0,5% нитрита натрия отмеривают пипеткой в пробирку из склянки на столе преподавателя. Готовую диазосмесь отмеривают пипеткой по 0,5мл в каждую пробу с сывороткой. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на 20 минут в темноту, затем фотометрируют с зеленым светофильтром (длина волны 530 нм), в кюветах 10 мм против контрольной пробы, в которой вместо сыворотки используют 1 мл дистиллированной воды.
Х= (6,34Д) – 0,05 = мг% 17,1 = мкмоль/л
где D – оптическая плотность
0,05 – поправка на окраску диазосмеси с кофеиновым реактивом
17,1 –коэффициент перерасчета в единицах СИ
Клинико-диагностическое значение определения
общего билирубина в сыворотке крови
В крови здорового человека уровень общего билирубина равен 8,5 20,5 мкмоль/л (0,4 0,8 мг/дл), причем около 75% этого количества приходится на долю непрямого билирубина (6,4 15,4 мкмоль/л).
Повышение содержания общего билирубина более 20,5 мкмоль/л называется гипербилирубинемией и является симптомом различных физиоло-гических и патологических состояний. Гипербилирубинемия более 3035 мкмоль/л сопровождается желтушной окраской склер и кожных покровов.
Физиологическая гипербилирубинемия это так называемая неонаталь-ная физиологическая желтуха новорожденных. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, что является следст-вием с одной стороны интенсивного гемолиза эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин (НbF), а с другой стороны, следствием незрелости гепатоцитов по захвату, коньюгации и экскреции коньюгированного билирубина.
Патологическая гипербилирубинемия может быть вызвана различными причинами, например:
гемолитическая гипербилирубинемия (гемолитическая желтуха) является следствием массивного гемолиза эритроцитов. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, при возможном повыше-нии и коньюгированного (прямого) билирубина. В свою очередь причины гемолиза делятся на биологические (малярия, переливание крови несовмести-мой по группе или резус-фактору) и химические (действие сильных окислите-лей и других тиоловых ядов, врожденные заболевания с гемолизом, например гемоглобинопатии (серповидноклеточная анемия) и энзимопатии (в частности по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе и метгемоглобинредуктазе).
врожденная неконьюгированная гипербилирубинемия (врожденная неге-
молитическая желтуха) является следствием метаболического дефекта в коньюгации билирубина за счет отсутствия или крайней низкой активности УДФГТ, что наблюдается при синдроме КлиглераНайяра и синдроме Жильбера. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина.
токсическая гипербилирубинемия (паренхиматозная желтуха) является следствием поражения клеток печени вирусами (вирус гепатита А, В, С, Д, цитомегаловирус), гепатотропными ядами (хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен, галотан, ацетаминофен (парацетомол), изониазид, рифампицин, -аманитин (токсин бледной поганки) и др.), а также имеет место при циррозе печени (синдром гепатоцеллюлярной недостаточности). Общий билирубин повышен преимущественно за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина. Коньюгированный (прямой) билирубин может быть в норме или повышен (при цитолизе).
коньюгированная гипербилирубинемия (обтурационная, холестатическая желтуха) является следствием механического препятствия оттоку желчи, что наблюдается при желчно-каменной болезни (калькулезный холецистит) и при наличии опухоли, перекрывающей желчевыводящие пути (опухоль главного желчевыводящего протока, опухоль головки поджелудочной железы и др.). Общий билирубин повышен за счет коньюгированного (прямого) билирубина.
врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая идиопа-тическая желтуха) является следствием дефекта в экскреции коньюгирован-ного билирубина в желчь. Наблюдается при синдроме Дубина-Джонсона. Общий билирубин повышен за счет прямого билирубина. При гистологи-ческом исследовании ткани печени выявляется меланоз с неидентифицированным пигментом.
врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая негемо-литическая желтуха) предположительно является следствием нарушения экскреторной функции печени, наблюдается при синдроме Ротора, при гистологическом исследовании ткани печени патологических изменений не находят.
Неконьюгированный билирубин может проходить гематоэнцефалический барьер в случае его повышенного содержания в крови и приводить к пораже-нию мозга (ядерная желтуха). Для предотвращения развития энцефалопатии применяют индукторы УДФГТ (фенобарбитал, люминал), например для коррекции состояния у недоношенных новорожденных детей.
Тестовый контроль по теме: Химия крови.
Выберите правильнЫй ответ
Непрямой билирубин превращается в прямой билирубин связываясь:
а) с сывороточным альбумином
б) в печени с бензойной кислотой
в) в печени с ФАФС (3-фосфоаденин 5-фосфосульфат)
г) в печени с уридинфосфоглюкуроновой кислотой (УДФ ГК)
Выберите правильнЫй ответ
Причиной порфирий является:
б) нарушение синтеза глобина
в) нарушение синтез билирубина
г) нарушение образования в кишечнике уробилиногена, стеркобилино-гена и стеркобилина
д) нарушение проницаемости мембран эритроцита
Выберите правильнЫй ответ
б) 4 полипептидных цепей -1,-2,-1, -2, соединенного с 4 молекулами гема
в) 1 полипептидной цепи, соединенной с одной молекулой гема
г) 2 полипептидных цепей, соединеных с 2 молекулами гема
д) 2 полипептидных цепей, соединенных с 1 молекулой гема
Выберите правильнЫй ответ
Причина серповидной клеточной анемии:
а) нарушение процесса всасывания железа
в) изменение в результате мутации первичной структуры полипептидной цепи
г) изменена вторичная структура -1, -2, -1, -2 цепей
д) изменена третичная структура -1, -2, -1, -2
источник
Лабораторная работа № 14 Количественное определение общего билирубина в сыворотке крови по методу Ендрассика и Клехгорна.
Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина в сыворотке крови.
Мотивация: Билирубин продукт ферментативного окисления гемоглобина (конечный продукт распада гема), образующийся в результате естественного распада эритроцитов в клетках РЭС, относится к группе желчных пигментов. Билирубин вещество токсичное, т.к. молекула билирубина является гидрофобной и может проникать в клетки головного мозга. Поэтому в организме человека существуют реакция обезвреживания билирубина, которая протекает в печени.
где УФДГК кофермент уридиндифосфат глюкуроновая кислота, УДФГТ фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.
Билирубиндиглюкуронид экскретируется с желчью в ЖКТ, где высвобождается из коньюгата, восстанавливается до уробилиногена, затем превращается в стеркобилиноген, в форме которого и выводится из организма человека.
Принцип метода: в основе определения билирубина лежит реакция азосочетания билирубина с диазосмесью Эрлиха, в результате которой появляется малиновокрасная окраска за счет образующегося азобилирубина. Концентрация последнего определяется фотоколориметрически.
Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно (прямой билирубин по старой терминологии), тогда как свободный билирубин неустойчив в растворе в сильно кислой среде, при которой происходит реакция азосочетания и требует присутствия стабилизатора, роль которого могут играть кофеин, спирт, мочевина, ацетат, бензонат натрия и др. (непрямой билирубин).
1. Химические пробирки, бюретки, пипетки на 10мл и 1 мл; 2. Раствор сульфаниловой кислоты 0,5%; 3. Раствор нитрита натрия 0,5% (готовится еженедельно); 4. Кофеиновый реактив: кофеина чистого 5г, бензойнокислого натрия – 37,5г, уксуснокислого натрия – 62,5г, растворяются при нагревании: раствор доводится дистиллированной водой до 1л; 5. Сыворотки крови с различными концентрациями билирубина.
Ход работы: в химическую пробирку из бюреток отмеривают 1 мл сыворотки и 2,5 мл кофеинового реактива. Диазосмесь готовят в одной пробирке на всю группу следующим образом: 10 мл 0,5% раствора сульфаниловой кислоты и 0,25мл 0,5% нитрита натрия отмеривают пипеткой в пробирку из склянки на столе преподавателя. Готовую диазосмесь отмеривают пипеткой по 0,5мл в каждую пробу с сывороткой. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на 20 минут в темноту, затем фотометрируют с зеленым светофильтром (длина волны 530 нм), в кюветах 10 мм против контрольной пробы, в которой вместо сыворотки используют 1 мл дистиллированной воды.
Х= (6,34Д) – 0,05 = мг% 17,1 = мкмоль/л
где D – оптическая плотность
0,05 – поправка на окраску диазосмеси с кофеиновым реактивом
17,1 –коэффициент перерасчета в единицах СИ
Клинико-диагностическое значение определения
общего билирубина в сыворотке крови
В крови здорового человека уровень общего билирубина равен 8,5 20,5 мкмоль/л (0,4 0,8 мг/дл), причем около 75% этого количества приходится на долю непрямого билирубина (6,4 15,4 мкмоль/л).
Повышение содержания общего билирубина более 20,5 мкмоль/л называется гипербилирубинемией и является симптомом различных физиоло-гических и патологических состояний. Гипербилирубинемия более 3035 мкмоль/л сопровождается желтушной окраской склер и кожных покровов.
Физиологическая гипербилирубинемия это так называемая неонаталь-ная физиологическая желтуха новорожденных. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, что является следст-вием с одной стороны интенсивного гемолиза эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин (НbF), а с другой стороны, следствием незрелости гепатоцитов по захвату, коньюгации и экскреции коньюгированного билирубина.
Патологическая гипербилирубинемия может быть вызвана различными причинами, например:
гемолитическая гипербилирубинемия (гемолитическая желтуха) является следствием массивного гемолиза эритроцитов. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина, при возможном повыше-нии и коньюгированного (прямого) билирубина. В свою очередь причины гемолиза делятся на биологические (малярия, переливание крови несовмести-мой по группе или резус-фактору) и химические (действие сильных окислите-лей и других тиоловых ядов, врожденные заболевания с гемолизом, например гемоглобинопатии (серповидноклеточная анемия) и энзимопатии (в частности по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе и метгемоглобинредуктазе).
врожденная неконьюгированная гипербилирубинемия (врожденная неге-
молитическая желтуха) является следствием метаболического дефекта в коньюгации билирубина за счет отсутствия или крайней низкой активности УДФГТ, что наблюдается при синдроме КлиглераНайяра и синдроме Жильбера. Общий билирубин повышен за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина.
токсическая гипербилирубинемия (паренхиматозная желтуха) является следствием поражения клеток печени вирусами (вирус гепатита А, В, С, Д, цитомегаловирус), гепатотропными ядами (хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен, галотан, ацетаминофен (парацетомол), изониазид, рифампицин, -аманитин (токсин бледной поганки) и др.), а также имеет место при циррозе печени (синдром гепатоцеллюлярной недостаточности). Общий билирубин повышен преимущественно за счет неконьюгированного (непрямого) билирубина. Коньюгированный (прямой) билирубин может быть в норме или повышен (при цитолизе).
коньюгированная гипербилирубинемия (обтурационная, холестатическая желтуха) является следствием механического препятствия оттоку желчи, что наблюдается при желчно-каменной болезни (калькулезный холецистит) и при наличии опухоли, перекрывающей желчевыводящие пути (опухоль главного желчевыводящего протока, опухоль головки поджелудочной железы и др.). Общий билирубин повышен за счет коньюгированного (прямого) билирубина.
врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая идиопа-тическая желтуха) является следствием дефекта в экскреции коньюгирован-ного билирубина в желчь. Наблюдается при синдроме Дубина-Джонсона. Общий билирубин повышен за счет прямого билирубина. При гистологи-ческом исследовании ткани печени выявляется меланоз с неидентифицированным пигментом.
врожденная коньюгированная гипербилирубинемия (хроническая негемо-литическая желтуха) предположительно является следствием нарушения экскреторной функции печени, наблюдается при синдроме Ротора, при гистологическом исследовании ткани печени патологических изменений не находят.
Неконьюгированный билирубин может проходить гематоэнцефалический барьер в случае его повышенного содержания в крови и приводить к пораже-нию мозга (ядерная желтуха). Для предотвращения развития энцефалопатии применяют индукторы УДФГТ (фенобарбитал, люминал), например для коррекции состояния у недоношенных новорожденных детей.
Тестовый контроль по теме: Химия крови.
Выберите правильнЫй ответ
Непрямой билирубин превращается в прямой билирубин связываясь:
а) с сывороточным альбумином
б) в печени с бензойной кислотой
в) в печени с ФАФС (3-фосфоаденин 5-фосфосульфат)
г) в печени с уридинфосфоглюкуроновой кислотой (УДФ ГК)
Выберите правильнЫй ответ
Причиной порфирий является:
б) нарушение синтеза глобина
в) нарушение синтез билирубина
г) нарушение образования в кишечнике уробилиногена, стеркобилино-гена и стеркобилина
д) нарушение проницаемости мембран эритроцита
Выберите правильнЫй ответ
б) 4 полипептидных цепей -1,-2,-1, -2, соединенного с 4 молекулами гема
в) 1 полипептидной цепи, соединенной с одной молекулой гема
г) 2 полипептидных цепей, соединеных с 2 молекулами гема
д) 2 полипептидных цепей, соединенных с 1 молекулой гема
Выберите правильнЫй ответ
Причина серповидной клеточной анемии:
а) нарушение процесса всасывания железа
в) изменение в результате мутации первичной структуры полипептидной цепи
г) изменена вторичная структура -1, -2, -1, -2 цепей
д) изменена третичная структура -1, -2, -1, -2
источник
Определение общего билирубина в сыворотке крови
(метод Иендрашика и Клеггорна)
Принцип метода. Билирубин образуется в организме в результате естественного распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень,селезенка). Билирубин относится к группе желчных пигментов и является токсическим веществом; он обезвреживается в клетках печени. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком. В печени происходит процесс обезвреживания по схеме:
билирубин + УДФ-глюкуроновая кислота билирубин (моно- и диглюкуроид)
Глюкурониды билирубина хорошо растворимы, они выводятся из печени по желчевыводящим путям.
В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый (диглюкуронид ). Вместе обе формы составляют общий билирубин.
Определение содержания билирубина в крови является важным диагностическим тестом. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах-0,5-1,2 мг/дл, причем 75% из них составляет билирубин, связанный с белками (нерастворимый).
При различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия, концентрация билирубина повышается до 30-35 мг/дл.
Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окраски продукта взаимодействия билирубина с диазореактивом. Этот продукт окрашен в малиново-красный цвет. Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно.
Связанный с белками билирубин реагирует с диазосмесью после диссоциации белкового комплекса, которая достигается прибавлением к сыворотке кофеинового реактива.
Ход определения. Готовят две пробирки (контрольную и опытную). Составляют реакционную смесь по схеме:
| Проба | Сыворотка крови, мл | Кофеиновый реактив, мл | Дистиллированная вода, мл | Диазосмесь, мл |
| Опытная | 3,5 | — | 0,5 | |
| Контрольная | — | 3,5 | 0,5 |
Диазосмесь готовят (в количестве, достаточном для всей учебной группы), смешивая 10 мл 0,5%-ного раствора сульфаниловой кислоты и 0,3 мл 0,5%-ного раствора нитрата натрия.
Содержимое опытной и контрольной проб хорошо перешивают, ставят на 20 минут в темноту, затем колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 500-560 нм) против контроля.
Если в пробах развивается слабая окраска, то перед колориметрированием в обе пробирки добавляют по 3 капли 30%-ного раствора NaOH. При этом цвет раствора переходит в зеленый, а при большей концентрации билирубина в синий, часто наблюдается исчезновение мути. Пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром. Расчет производят по калибровочному графику.
Калибровочный график для определения концентрации общего билирубина.
Оформление работы. В протокол вносят принцип метода, результаты колориметрии и расчет. Отмечают пределы колебаний концентрации билирубина в норме.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Студент — человек, постоянно откладывающий неизбежность. 11128 — | 7501 — или читать все.
источник