Содержание гемоглобина в крови крыс при облучении и возможность ее коррекции биологически активными веществами
Особенности влияния рентгеновского излучения на гематологические показатели крови крыс на фоне приема различных штаммов спирулины и смеси витаминов. Влияние пищевых добавок на гематологические показатели крови у лабораторных животных при облучении.
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru
Размещено на http://www.allbest.ru
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ, МОЛОДЕЖИ И СПОРТА УКРАИНЫ
ОДЕССКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени И.И.МЕЧНИКОВА
Кафедра физиологии человека и животных
Содержание гемоглобина в крови крыс при облучении и возможность ее коррекции биологически активными веществами
Старыш Марианны Степановны
1.1 Структура и функции эритроцитов и гемоглобина
1.2 Биологическое действие ионизирующих излучений
1.3 Виды ионизирующих излучений и их свойства
1.4 Влияние радиоактивного излучения на морфологию и функции клеток крови
2. Материалы и методы исследования
2.1 Определение содержания гемоглобина
2.2 Характеристика использованной культуры срирулины
2.3 Статистическая обработка
3. Результаты и их обсуждение
Список цитируемой литературы
Широкое распространение ядерных технологий влечет за собой неизбежное расширение круга людей, подвергающихся воздействию ионизирующего излучения.
Радиационные катастрофы приводят к облучению большого количества людей и увеличению загрязнений окружающей среды. В результате Чернобыльской катастрофы пострадали значительные территории, на которых сейчас проживает сотни тысяч человек [Лютых, Долгих 1998].
Влияние ионизирующих излучений на организм представляет большой интерес науки и практической медицины. Значительное количество работ направлено на изучение изменений в системе крови в результате радиационных воздействий.
Множество исследований посвящено влиянию изучения большой интенсивности, влиянию малых доз излучения на организм должное внимание уделяется лишь в последнее время [Григорьев, 2000].
На сегодняшний момент также большое внимание уделяется различным пищевым добавкам, которые обладают профилактическим и лечебным действием при различных патологических состояниях. Особенно широкое распространение в данном направлении получила синезеленая водоросль Spirulina platensis.
В состав спирулины входит большое количество белка, углеводов, селена, железа, витаминов.
Результаты многочисленных клинических исследований показали, что спирулина обладает гиполипидемическим, детоксикационным, антиоксидантным свойствами, приводит к нормализации кислотно- основного равновесия, белково- углеводного обмена, также приводит к положительным результатам при лечении атеросклероза, хронической ишемический болезни сердца, онкологических заболеваний [Brown, Karakis, 1997].
В связи с этим целью данной работы являлось изучение особенностей влияния рентгеновского излучения в дозах 6 Гр на гематологические показатели крови крыс на фоне приема различных штаммов спирулины и смеси витаминов.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Определить содержание гемоглобина крыс, подвергнутых облучению в дозе 6 Гр.
2. Определить количество гемоглобина в крови крыс, подвергнутых облучению в дозе 6 Гр на фоне приема различных комбинаций факторов (штаммов спирулины, смеси витаминов + УВЧ).
Объект исследования — влияние пищевых добавок на гематологические показатели крови у лабораторных животных при действии облучения.
Предмет исследования — определение содержания гемоглобина и эритроцитов крыс, подвергавшихся однократному облучению на фоне приема различных штаммов спирулины и смеси витаминов.
рентгеновское облучение гематологический
1.1 Структура и функции эритроцитов и гемоглобина
В крови человека эритроциты имеют преимущественно форму двояковогнутого диска. Поверхность диска в 1,7 раза больше, чем поверхность тела такого же объема, но сферической формы; при этом диск умеренно изменяется без растяжения мембраны клетки. Несомненно, форма двояковогнутого диска, увеличивая поверхность эритроцита, обеспечивает транспорт большего количества различных веществ. Кроме того, такая форма позволяет эритроцитам закрепляться в фибриновой сети при образовании тромба. Но главное преимущество заключается в том, что форма двояковогнутого диска обеспечивает прохождение эритроцита через капилляры. При этом эритроцит перекручивается в узкой средней части, его содержимое из более широкого конца перетекает к центру, благодаря чему эритроцит свободно входит в узкий капилляр. Форма эритроцитов здоровых людей весьма вариабельна — от двояковогнутой линзы до тутовой ягоды.
Эритроцит окружен плазматической мембраной, структура которой мало отличается от таковой других клеток. Наряду с тем, что мембрана эритроцита проницаема для катионов Na + и К + , она особенно хорошо пропускает О2, СО2, Сl — и HCO 3- . Цитоскелет в виде проходящих через клетку трубочек и микрофиламентов в эритроците отсутствует, что придает ему эластичность и деформируемость — столь необходимые свойства при прохождении через узкие капилляры.
Размеры эритроцита весьма изменчивы, но в большинстве случаев их диаметр равен 7,5—8,3 мкм, толщина — 2,1 мкм, площадь поверхности — 145 мкм 2 , объем — 86 мкм3.
В норме число эритроцитов у мужчин равно 4—5*10 12 /л, или 4 000 000—5 000 000 в 1 мкл. У женщин число эритроцитов меньше и, как правило, не превышает 4,5*10 12 /л. При беременности число эритроцитов может снижаться до 3,5-10 12 /л и даже до 3,0*10 12 /л, и это многие исследователи считают нормой [Черниговский, 1979].
У человека с массой тела 60 кг общее число эритроцитов равняется 25 триллионам. Если положить все эритроциты одного человека один на другой, то получится «столбик» высотой более 60 км.
В норме число эритроцитов подвержено незначительным колебаниям. При различных заболеваниях количество эритроцитов может уменьшаться. Подобное состояние носит название «эритропения» и часто сопутствует малокровию или анемии. Увеличение числа эритроцитов обозначается как «эритроцитоз» [ Кузник, Скипетров, 1975].
Многие функции эритроцитов осуществляются при непосредственном участии гемоглобина.
Гемоглобин — дыхательный пигмент крови человека и позвоночных животных, выполняет в организме роль переносчика кислорода и принимает участие в транспорте углекислого газа. У мужчин в крови содержится в среднем 140 — 160 г/л гемоглобина, у женщин — 120 — 140 г/л.
Гемоглобин представляет собой сложное химическое соединение, состоящее из 600 аминокислот, его молекулярная масса равна 66000 ± 2000 и состоит из белка глобина и четырех молекул гема. Гем, содержащий атом железа, обладает способностью присоединять или отдавать молекулу кислорода. При этом валентность железа, к которому присоединяется кислород, не меняется, т. е. железо остается двухвалентным. Гем является активной, или так называемой простетической, группой.
В скелетной и сердечной мышцах находится мышечный гемоглобин, или миоглобин. Его простетическая группа — гем — идентична гему молекулы гемоглобина крови, а белковая часть — глобин обладает меньшей молекулярной массой, чем белок гемоглобина. Миоглобин человека связывает до 14% общего количества кислорода в организме. Он играет важную роль в снабжении кислородом работающих мышц.
Синтезируется гемоглобин в клетках красного костного мозга. Для нормального синтеза гемоглобина необходимо достаточное поступление железа. Разрушение молекулы гемоглобина осуществляется преимущественно в клетках мононуклеарной фагоцитарной системы (ретикулоэндотелиальная система), к которой относятся печень, селезенка, костный мозг, моноциты. При некоторых заболеваниях крови обнаружены гемоглобины, отличающиеся по химической структуре и свойствам от гемоглобина здоровых людей. Эти виды гемоглобина получили название аномальных гемоглобинов.
Гемоглобин выполняет свои функции лишь при условии нахождения его в эритроцитах. Если по каким-то причинам гемоглобин появляется в плазме (гемоглобинемия), то он неспособен выполнять свои функции, так как быстро захватывается клетками мононуклеарной фагоцитарной системы и разрушается, а часть его выводится почкам (гемоглобинурия). Появление в плазме большого количества гемоглобина увеличивает вязкость крови, повышает величину онкотического давления, что приводит к нарушению движения крови и образования тканевой жидкости.
Дыхательная функция гемоглобина осуществляется за счет переноса кислорода от легких к тканям и углекислого газа от клеток к органам дыхания. Регуляция активной реакции крови или кислотно — щелочного состояния связана с тем, что гемоглобин обладает буферными свойствами.
Гемоглобин, присоединивший к себе кислород, превращается в оксигемоглобин (НЬО2). Кислород с гемом гемоглобина образует непрочное соединение, в котором железо остается двухвалентным (ковалентная связь). Гемоглобин, отдавший кислород, называется восстановленным, или редуцированным, гемоглобином (НЬ). Гемоглобин, соединенный с молекулой углекислого газа, называется карбгемоглобин (НЬСО2). Углекислый газ с белковым компонентом гемоглобина также образует легко распадающееся соединение.
Таким образом, основной дыхательный пигмент и главный компонент эритроцитов, состоит из белковой части (глобина) и железосодержащей порфириновой части (гема). Функции гемоглобина: перенос кислорода из лёгких в ткани и транспорт углекислого газа и протонов из тканей в лёгкие; поддержание кислотно-основного равновесия крови — буферная система, создаваемая гемоглобином, способствует сохранению рН крови в определённых пределах [Косицкий, 1985].
1.2 Биологическое действие ионизирующих излучений
Биологическая эффективность ионизирующих излучений необычайно высока. По глубине и силе воздействия на организмы ионизирующая радиация значительно превосходит все известные виды излучений. К такому выводу пришли еще в начале века, когда впервые подвергали облучению различные виды животных, отдельные органы и ткани. Можно с уверенностью сказать, что практически нет ни одного организма, который невозможно было бы убить ионизирующим излучением, нет такой жизненной функции, которая не подавлялась бы в результате радиационного воздействия [Гладкій, Сьомік, Коломійчук, 2003].
Основа физического воздействия ядерных излучений на живые организмы — ионизация атомов и молекул в клетках.
При облучении человека смертельной дозой гамма-излучения, равной 6 Гр, в его организме выделяется энергия, равная примерно:
Такая энергия передается организму человека одной чайной ложкой горячей воды. Поскольку эта энергия мала, естественно предположить, что тепловое воздействие ионизирующей радиации не является непосредственной причиной лучевой болезни и гибели человека. Действительно, основной механизм биологического воздействия ионизирующей радиации на живой организм обусловлен химическими процессами, происходящими в живых клетках после их облучения.
Организм млекопитающего состоит примерно на 75% из воды. При дозе 6 Гр в 1 см 3 ткани происходит ионизация примерно 10 15 молекул воды. Процессы ионизации и химических взаимодействий продуктов ионизации происходят в клетке за миллионные доли секунды. Биохимические изменения в клетке, обусловленные образованием новых молекул, чуждых нормальной клетке, начинаются сразу после момента облучения, но не завершаются за короткое время. Некоторые следствия биохимических изменений в клетке проявляются уже через несколько секунд после облучения, другие могут привести к гибели клетки или ее раковому перерождению через десятилетия [Боголюбов, Пономаренко, 1998].
Одним из первых следствий действия облучения на живую клетку является нарушение ее функции деления как самой сложной функции. Поэтому в первую очередь нарушаются функции органов и тканей организма, в которых происходит деление клеток, образование новых клеток [Голощапов, Горбунова и др., 1994].
1.3 Виды ионизирующих излучений и их свойства
Наиболее разнообразны по видам ионизирующих излучений так называемые радиоактивные излучения, образующиеся в результате самопроизвольного радиоактивного распада атомных ядер элементов с изменением физических и химических свойств последних. Элементы, обладающие способностью радиоактивного распада, называются радиоактивными; они могут быть естественными, такие, как уран, радий, торий и др. (всего около 50 элементов), и искусственными, для которых радиоактивные свойства получены искусственным путем (более 700 элементов).
При радиоактивном распаде имеют место три основных вида ионизирующих излучений: альфа, бета и гамма.
Альфа-частица — это положительно заряженные ионы гелия, образующиеся при распаде ядер, как правило, тяжелых естественных элементов (радия, тория и др.). Эти лучи не проникают глубоко в твердые или жидкие среды, поэтому для защиты от внешнего воздействия достаточно защититься любым тонким слоем, даже листком бумаги.
Бета-излучение представляет собой поток электронов, образующихся при распаде ядер как естественных, так и искусственных радиоактивных элементов. Бета-излучения обладают большей проникающей способностью по сравнению с альфа-лучами, поэтому и для защиты от них требуются более плотные и толстые экраны. Разновидностью бета-излучений, образующихся при распаде некоторых искусственных радиоактивных элементов, являются. позитроны. Они отличаются от электронов лишь положительным зарядом, поэтому при воздействии на поток лучей магнитным полем они отклоняются в противоположную сторону.
Гамма-излучение, или кванты энергии (фотоны), представляют собой жесткие электромагнитные колебания, образующиеся при распаде ядер многих радиоактивных элементов. Эти лучи обладают гораздо большей проникающей способностью. Поэтому для экранирования от них необходимы специальные устройства из материалов, способных хорошо задерживать эти лучи (свинец, бетон, вода). Ионизирующий эффект действия гамма-излучения обусловлен в основном как непосредственным расходованием собственной энергии, так и ионизирующим действием электронов, выбиваемых из облучаемого вещества.
Рентгеновское излучение образуется при работе рентгеновских трубок, а также сложных электронных установок (бетатронов и т. п.). По характеру рентгеновские лучи во многом сходны с гамма-лучами и отличаются от них происхождением и иногда длиной волны: рентгеновские лучи, как правило, имеют большую длину волны и более низкие частоты, чем гамма-лучи. Ионизация вследствие воздействия рентгеновских лучей происходит в большей степени за счет выбиваемых ими электронов и лишь незначительно за счет непосредственной траты собственной энергии. Эти лучи (особенно жесткие) также обладают значительной проникающей способностью.
Радиоактивные элементы могут присутствовать в виде твердых тел, жидкостей и газов, поэтому, помимо своего специфического свойства излучения, они обладают соответствующими свойствами этих трех состояний; они могут образовывать аэрозоли, пары, распространяться в воздушной среде, загрязнять окружающие поверхности, включая оборудование, спецодежду, кожный покров рабочих и т. д., проникать в пищеварительный тракт и органы дыхания [Кузин, 1977]
1.4 Влияние радиоактивного излучения на морфологию и функции клеток крови
Радиочувствительность клетки прямо пропорциональна ее митотической активности и обратно пропорциональна степени ее дифференциации [Коггл, 1986] Наиболее чувствительными оказываются ткани с интенсивным делением: эпителиальная, кровь. Наиболее радиорезистентными являются ткани, утратившие способность к делению: мышечная, нервная, костная и хрящевая ткани.
Для всех клеток организма механизм воздействия радиации одинаков, он заключается в повреждении клетки прямым или косвенным образом. Прямое воздействие заключается в изменении структуры молекул, косвенное осуществляется через механизм радиолиза воды, в результате которого образуются ионы водорода и гидроксильные группы, которые мгновенно реагируют с структурными компонентами клетки.
Существуют общие закономерности в изменениях качественного и количественного состава периферической крови под воздействием ионизирующих излучений.
Из-за высокой чувствительности клеток костного мозга, связанной с их интенсивным делением и дифференциацией, наблюдаются сильные изменения в периферической крови под воздействием радиации. Дозы в 2 — 10 Гр вызывают гибель клеток костного мозга непосредственно в момент облучения или в митозах, при этом клетки теряют способность к делению. Нарушения выявляются сначала в гранулоцитопоэзе, затем в тромбоцитопоэзе, значительно позднее — в эритропоэзе.
Наблюдается обеднение костного мозга ранними предшественниками кроветворения, т.к. эти клетки — малодифференцированные, интенсивно делящиеся, а следовательно и радиочувствительные. Поздние предшественники клеток периферической крови менее радиочувствительны, кроме предшественников лейкоцитов и эритроцитов [Ярмоненко, 1988]. Из-за резкого сокращения пула предшественников продукция зрелых форм в костном мозге временно снижается. Падение числа форменных элементов крови сопровождается включением компенсаторных механизмов, выражающихся в ускорении созревания клеток в костном мозге [Гольдберг, Воробьева, 1970, 1978], уменьшении их жизнеспособности.
Число циркулирующих эритроцитов по данным одних авторов, уменьшается [Гольдберг, 1966], другие исследователи приводят противоположные данные: в промежутке доз от 0,05 до 0,25 Гр в крови крыс обнаруживается увеличение числа эритроцитов [Кейзер, Молчанов, 1968]. Это явление увеличения показателей при облучении в малых дозах оправдано недавними исследованиями и получило название гормезиса [Гусаров, 1999; Ярмоненко, 1997]. Предположительно, эффект усиления вызван стимуляцией центров нейроэндокринной регуляции.
Облучение в дозе 2 Гр вызывает повышение устойчивости эритроцитов по показателю начала гемолиза на 4 сутки, через месяц после облучения в 1 Гр резистентность незначительно, но достоверно снижается по показателям начала и максимального нарастания гемолиза [Божок, 1994].
Снижением количества гемоглобина после радиационного воздействия объясняется снижение кислородной емкости крови, при этом в 2-3 раза возрастает способность гемоглобина к включению соединений [Гусаров, 1999; Ярмоненко, 1997]. Также снижается содержание общего железа в плазме крови вследствие снижения числа эритроцитов. Увеличивается скорость включения железа в эритроциты и железо-связывающая способность плазмы. Снижается концентрация сывороточного ферритина, необходимого для синтеза гемма [Божок, 1994].
Количество лейкоцитов в периферической крови уменьшается, независимо от типа излучения и его длительности но в диапазоне доз 2,5-5Р (?0,025-0,005 Гр) исследователи заметили увеличение количества лейкоцитов.
При более высоких дозах наряду с уменьшением числа лейкоцитов в циркулирующей крови исследователи отмечают усиление лейкопоэза, что выражается в ускорении выхода лейкоцитов из костного мозга в кровь [Косицкий, 1985] увеличивается количество молодых клеток, в лейкоцитарной формуле наблюдается сдвиг влево.
Уменьшается осмотическая резистентность лейкоцитов [Косицкий, 1985]. Снижение числа лейкоцитов в периферической крови на фоне увеличения их продукции в костном мозге, по — видимому, связано с перераспределительными реакциями лейкоцитов, уменьшением их продолжительности жизни и резким снижением числа нейтрофилов [Гольдберг, 1966; Котеров, 2000].
Изучено изменение содержания тромбоцитов. Большинство исследователей отмечают снижение их количества в ближайшие и отдаленные периоды воздействия, при хронических и однократных облучениях. В ближайшие 2 месяца после облучения количество тромбоцитов сначала падает, затем повышается и достигает стабильной величины на 35-52 сутки, не достигая первоначального уровня.
2. Материалы и методы исследования
2.1 Определение содержания гемоглобина
Для измерения содержания гемоглобина использовали способ спектрофотометрии. Принцип метода состоит в том, что гемоглобин в присутствии окислителя образует в водном растворе цианметгемоглобин, окраска которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови. Таким образом нестабильный растворенный гемоглобин переводят в стабильную форму.
Для определения использовали такие реагенты:
1. Окислительные реагенты — (50 ± 2) мл;
— калий железосинеродистый (10 ± 0,5) г/л;
— бикарбонат натрия (50 ± 2) г/л;
2. Калибровочный раствор гемоглобинцианида (соответствовал пробе крови с концентрацией гемоглобина 150 ± 3 г/л).
3. Ацетоциангидрид (1 ± 0,2) мл.
Трансформирующий раствор приготовили путем переноса окислительного реагента и ацетонциангидрида в мерную колбу объемом 2000 мл. Добавили до метки дистиллированной водой и перемешали. Исследуемую пробу 0,02 мл крови осторожно смешали, препятствуя образованию пены, с 5 мл трансформирующего раствора. Выдержали 15 минут и фотометрировали против трансформирующего раствора. Измерили оптическую плотность калибровочного раствора гемоглобинцианида против трансформирующего раствора при длине волны 540 нм, красным светофильтре, на спеколе. Концентрацию гемоглобина рассчитали по формуле:
где 150- концентрация гемоглобина в калибровочной пробе, г/л; Еисл.— оптическая плотность исследуемой пробы, единица оптической плотности: Екал. — оптическая плотность калибровочной пробы, единица оптической плотности.
В норме 13 крови крыс 128 — 192 г/л гемоглобина.
2.2 Характеристика использованной культуры срирулины
В исследовании были использованы мутантные штаммы С-27 и 198Б. Штаммы получены с помощью нитрозогуанидинового мутагенеза путем ступенчатой позитивной селекции на устойчивость к ВЬ-этионину (аналогу метионина). Мутагенез проводился в точном соответствии с методикой, описанной Миллером [Каракис, 1994]. С помощью мутагенеза М-метил-М-нитро-М-нитрогуанидина в концентрации 100мкг/мл. Штаммы С-27 характеризуются глубокой окраской трихомов, устойчивостью к 0,02 мт/мл ОЬ-этионина (аналога метионина) и 8-2 аминоэтилцистенина (аналога мизина). По сравнению со штаммом дикого типа штамм С-27 содержит в биомассе на 30% больше сырого протеина (по Кьельдалю) [Горбань, Купраш, 2003].
Штамм 198Б. Максимально переносимая им концентрация ОЬ-этионина 2,5 мг/мл. Штамм содержит в биомассе 81% сырого протеина 4,6% свободных аминокислот. Содержание метионина 3,07% от веса сухой биомассы.
Исходные культуры выращивали при оптимальной температуре 28-3 8°С и освещении 2- 2,5 кЛК на жидкой питательной минеральной среде Зарука, приготовленной по рецептуре, описанной в монографии [Скачек, Дерев’янко, 1995]. Культуру выращивали в микробиологических матрасах при барботаци воздухом, обеспечивающего перемешивание и интенсивный газообмен. Биомассу для биохимических исследований дикого и мутантного штаммов собирали после выхода культур в стационарную фазу. Сбор биомассы производился фильтрованием культуры через мельничный газ.
Расчет достоверности различий между средними арифметическими величинами использовали критерий Стьюдента (I) и различия считали достоверными, если уровень значимости (р) был не более 0,05 (5%), т.е. при вероятности различий не менее 0,95 (95%) [Плохинский, 1978].
2.3 Статистическая обработка
Статистическую обработку данных (обсчет средних величин, ошибок средних величин, коэффициента корреляции, критерия Стьюдента) проводили с использованием программы «Microsoft Excel» для Windows-2000.
Статистическая обработка результатов предполагает подсчет следующих величин:
x=; M — среднее значение, n — выборка
m — среднее квадратичное отклонение (ошибка), Рx-xiР — отклонение от среднего значения, Рx-xiР 2 — среднее квадратическое отклонение.
k=n1+n2-2; k — число степеней свободы.
tф — фактическое значение критерия Стьюдента.
m1- среднее квадратичное отклонение опытных значений;
mk- среднее квадратичное отклонение контрольных значений;
x1- среднее значение опытной группы;
xk- среднее значение контрольной группы;
tst — стандартное значение критерия Стьюдента — это табличное значение определяется с учетом к для разных уровней достоверности. В данном случае k=18, и, согласно таблицам, tst=2.
3. Результаты и их обсуждение
Проведение эксперимента по выявлению протекторного действия различных комбинаций факторов (УВЧ, ВК, пищевая добавка из биомассы Spirulina platensis штаммы 198 В и 27) в условиях однократного облучения в суммарной поглощенной дозе 6 Гр показало, что содержание гемоглобина в крови экспериментальных крыс претерпевает существенные изменения.
Первая группа животных не подвергалась облучению и была интактной (Табл.1).
Содержание гемоглобина в крови крыс до и после облучения
источник