Действие метаболитов оксида азота и карбонильных соединений на гемоглобин Насыбуллина Эльвира Ильгизовна
480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Насыбуллина Эльвира Ильгизовна. Действие метаболитов оксида азота и карбонильных соединений на гемоглобин: диссертация . кандидата Биологических наук: 03.01.04 / Насыбуллина Эльвира Ильгизовна;[Место защиты: ФГУ Федеральный исследовательский центр Фундаментальные основы биотехнологии Российской академии наук], 2017
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Гемоглобины: разнообразие и функции 10
1.1.1. Классификация гемоглобинов 10
1.1.2. Гемоглобины как кислородзависимые регуляторы метаболизма оксида азота 11
1.1.3. Мембраносвязанный гемоглобин эритроцитов 17
1.1.3.1. Физиологическая роль мембраносвязанного гемоглобина 17
1.1.3.2. Потенциальное использование мембраносвязанного гемоглобина в клинико-биохимической диагностике 24
1.2. Карбонильный стресс в биологических системах 26
1.2.1. Понятие карбонильного стресса 26
1.2.2. Способы защиты от карбонильного стресса 30
1.2.3. Методические подходы, применяемые для изучения карбонильного стресса 32
1.2.4. Карбонильный стресс в эритроцитах 34
1.2.4.1. Пути возникновения карбонильного стресса в эритроцитах 34
1.2.4.2. Роль гемоглобина в развитии последствий карбонильного стресса 38
1.3. Адсорбционный механизм регуляции клеточного метаболизма 39
1.4. Компьютерные экспертные системы в медицинской диагностике 43
1.4.1. Понятие об экспертной системе 43
1.4.2. Методы анализа данных в экспертных системах 45
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.2.1.Определение концентрации гемоглобина и его разных форм 48
2.2.2. Эксперименты с суспензией эритроцитов 49
2.2.3. Реакционная система для изучения нитрозилирования гемопротеидов 50
2.2.4. Реакционная система для изучения влияния доноров NO и метилглиоксаля на переход гемоглобина в связанное с мембранами состояние 50
2.2.5. Получение гликированного гемоглобина 51
2.2.6. Определение флуоресцирующих продуктов неферментативного гликирования гемоглобина 51
2.2.7. Восстановление дифенилтетразолий бромида 51
2.2.8. Распад нитрозоглутатиона 51
2.2.9. Определение SH-групп в низкомолекулярных и белковых тиолах 52
2.2.10. Определение пероксинитрита 52
2.2.11. Измерение антиоксидантной активности ДНКЖ 52
2.2.12. Регистрация спектров оптического поглощения 53
2.2.13. Регистрация спектров ЭПР 53
2.2.14. SDS-электрофорез в ПААГ 53
2.2.15. Методы статистического анализа данных для построения экспертной системы 54
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 56
3.1. Влияние метаболитов оксида азота на реакцию неферментативного гликирования (реакцию Майяра) 56
3.1.1. Ингибирование образования флуоресцирующих продуктов неферментативного гликирования донорами оксида азота 56
3.1.2. Образование динитрозильных комплексов железа с продуктами модификации гемоглобина и карнозина метилглиоксалем 60
3.2. Нитрозилирование и нитрование гемоглобина в условиях, моделирующих реакцию Майяра 68
3.2.1. Взаимодействие нитрозоглутатиона с гемоглобином в присутствии метилглиоксаля 68
3.2.2. Образование нитригемоглобина в системе, содержащей метилглиоксаль 79
3.3. Переход гемоглобина из растворимого в мембраносвязанное состояние в условиях различных видов стресса 86
3.3.1. Разработка методики определения мембраносвязанного гемоглобина 86
3.3.2. Взаимосвязь между уровнем мембраносвязанного гемоглобина и устойчивостью эритроцитов 90
3.3.3. Стабилизирующее действие глутатионовых ДНКЖ на эритроциты 97
3.3.4. Влияние метаболитов оксида азота на переход гемоглобина в мембраносвязанное состояние в условиях карбонильного стресса 102
3.4. Создание компьютерной экспертной системы для диагностики анемий 115
Актуальность проблемы
При метаболических нарушениях, приводящих к гипергликемии и кетонемии, в организме человека и животных накапливаются активные карбонильные соединения и конечные продукты гликирования аминокислот и белков [Kalapos, 2008a; Allaman et al., 2015]. Влияние этих соединений на физиологическую активность оксида азота (NO) является основной причиной нарушения вазодилятации при диабете [Turkseven et al., 2014; Alomar et al., 2016]. Важным фактором, влияющим на функционирование NO в сердечно-сосудистой системе, является гемоглобин (Hb). Гемоглобин может участвовать в образовании и в элиминации NO 2012; , 2014], а также выступать в качестве переносчика NO в форме нитрозотиолов [Zhang et al., 2016; Космачевская, Топунов, 2009] или динитрозильных комплексов негемового железа [Тимошин с соавт., 2007; Timoshin et al., 2007; Shumaev et al., 2008a,b; Ванин, 2015].
Особенности метаболизма эритроцитов увеличивают вероятность сочетания
окислительного, нитрозативного и карбонильного стрессов. В энергетическом отношении
эритроциты зависимы от потребления глюкозы, которая метаболизируется в реакциях
гликолиза и пентозофосфатного шунта. Интермедиаты этих реакций — триозофосфаты
являются основным источником активного дикарбонильного соединения — метилглиоксаля
(MG) [Richard, 1993; Allaman et al., 2015]. В результате спонтанного автоокисления Hb в
эритроцитах постоянно образуется супероксид-анион (О2* ). Этот процесс может усиливаться в
условиях гипоксии, когда возрастает дезоксигенация Hb и конформационное R-T равновесие
сдвигается в сторону T-формы, более склонной к автоокислению et al., 2013]. При
этом дезоксиHb, восстанавливая нитриты и нитросоединения, может продуцировать NO.
Одновременное образование в эритроцитах О2* и NO, а также наличие восстановленного
железа в составе гемовой группы и железа, высвободившегося при окислительной деградации
Hb, создают предпосылки для развития окислительного и нитрозативного стрессов. В этих
условиях образуются нитрозотиолы и динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), связанные с
гемоглобином, и низкомолекулярные, связанные с глутатионом [Shumaev et al., 2008]. К тому
же, длительный период жизни гемоглобина повышает вероятность образования связанных с Hb
конечных продуктов гликирования [Nathan et al., 2007]. Изменения структуры, заряда и
конформации белка вследствие гликирования аминокислотных остатков благоприятствуют
связыванию Hb с компонентами мембран и цитоскелета [Громов с соавт, 1988; Токтамысова,
Биржанова, 1991; Datta et al., 2008], а также образованию агрегатов из денатурированных и
сшитых молекул Hb (телец Гейнца) [Webster, 1949]. Повышенное количество мембраносвязанного Hb может быть связано со многими болезнями системы крови, вызванными нарушениями в системе антиоксидантной защиты и действием различных ксенобиотиков
Роль доноров NO при карбонильном стрессе неоднозначна. С одной стороны, NO может непосредственно взаимодействовать с продуктами неферментативного гликирования и предотвращать их дальнейшие превращения, с другой стороны, метаболиты NO могут участвовать в генерации свободнорадикальных интермедиатов. Поэтому представлялось актуальным изучение влияния оксида азота на процессы неферментативного гликирования и функционирование гемоглобина в условиях карбонильного стресса.
Цель и задачи исследования
Целью работы было изучение образования редокс-активных интермедиатов реакции неферментативного гликирования в присутствии метаболитов и доноров оксида азота и их действия на гемоглобин.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние метаболитов оксида азота на протекание реакции неферментативного гликирования (реакция Майяра) и образование в ходе этой реакции редокс-активных соединений.
Изучить влияние интермедиатов реакции Майяра на окислительную модификацию гемоглобина и его присоединение к компонентам мембраны.
Разработать методику определения мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах.
Изучить влияние метаболитов оксида азота на образование мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах, обработанных метилглиоксалем.
Разработать компьютерную экспертную систему для диагностики анемий и гемоглобинопатий различного генеза с использованием данных о мембраносвязанном гемоглобине.
Научная новизна работы
В системе, моделирующей карбонильный стресс, впервые было показано увеличение выхода свободнорадикальных интермедиатов под действием нитрозотиолов. Эти редокс-активные соединения вызывали нитрозилирование гемоглобина и нитрование винильной группы порфирина, а также присоединение гемоглобина к компонентам мембраны. Было установлено, что продукты взаимодействия метилглиоксаля с аминокислотными остатками гемоглобина и карнозина могут быть лигандами динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ). До настоящего исследования в научной литературе отсутствовали факты, описывающие способность оснований Шиффа участвовать в формировании ДНКЖ. Образование подобных
комплексов может быть одной из причин ингибирования реакции неферментативного гликирования метаболитами оксида азота.
Впервые было предложено рассматривать уровень связанного с мембранами гемоглобина (MBHb) в качестве дополнительного критерия оценки функционального состояния эритроцитов при хронической эндогенной интоксикации.
Научно-практическая значимость работы
В настоящее время рассматривается возможность использования показателя реактивности эритроцитов в качестве индикатора стрессового состояния или адаптационной реакции организма. Мы предлагаем производить оценку реактивности эритроцитов по содержанию МBHb. Уровень МBHb в крови также можно использовать в клинической диагностике в качестве дополнительного биохимического показателя выраженности интоксикационного синдрома. Разработанная в рамках данной работы методика спектрофотометрической оценки доли MBHb в эритроцитах может быть полезна для этих целей. Предложенная пилотная версия компьютерной экспертной системы, учитывающая данные о МBHb, может послужить основой для создания диагностического комплекса, направленного на повышение оперативности и точности при постановке диагноза в сфере заболеваний системы крови.
Выявленное цитопротекторное действие физиологических доз глутатионовых ДНКЖ может служить предпосылкой для применения этих метаболитов NO в качестве стабилизаторов эритроцитов при проведении фотодинамической терапии и при консервировании донорской крови. Использование этих комплексов может изменить характеристики зависимости «доза-ответ» эритроцитов, а также увеличить зону стабилизации.
Полученные в работе ДНКЖ с карнозиновыми лигандами можно рассматривать как потенциально новый класс фармакологических препаратов, функциональные группы которого обладают синергетическим терапевтическим действием и позволяют корректировать метаболизм оксида азота и эффективно защищать клетки сердечно-сосудистой системы и нервной ткани при окислительном и нитрозативном стрессах.
Положения диссертации, выносимые на защиту.
1.Установлено, что физиологические метаболиты оксида азота ингибируют реакцию неферментативного гликирования аминокислотных остатков гемоглобина и карнозина, индуцированную метилглиоксалем. Показано образование динитрозильных комплексов железа с продуктами модификации гемоглобина и карнозина метилглиоксалем. Формирование ДНКЖ является одним из механизмов антигликирующего действия метаболитов оксида азота.
2.Нитрозоглутатион при карбонильном стрессе стимулирует образование редокс-активных соединений, которые могут быть нитрозилирующими и нитрующими агентами и
вызывать окислительную модификацию метгемоглобина и его связывание с мембранами эритроцита.
3.Установлен диапазон нормальных значений для мембраносвязанного гемоглобина: 3,3% – 4,9%. Среди обследованных онкологических больных, которым была назначена химиотерапия, несоответствие норме уровня МBHb наблюдалось у 61%, в то время как в контрольной группе эта величина составляла 36%.
4.Разработана пилотная версия компьютерной экспертной системы для диагностики анемий у онкобольных, учитывающая данные о содержании мембраносвязанного гемоглобина.
Личный вклад диссертанта. Представленные в диссертационной работе экспериментальные данные получены лично автором, либо при его непосредственном участии на всех этапах исследований, включая планирование и проведение экспериментов, обработку, оформление и публикацию результатов.
Связь с государственными программами. Работа выполнена в рамках
государственной темы «Влияние активных метаболитов оксида азота и редокс-активных интермедиатов карбонильного стресса на функционирование гемоглобинов» (№ государственной регистрации 01201351362) и была поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты 12-04-01809, 13-04-00967, 14-04-01710), Российским гуманитарным научным фондом (грант 15-36-01024) и Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (Госконтракт № П808).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XIX и XXIII международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Крым, 2011, 2015); V международной научной конференции «Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, Белоруссия, 2014); IV Международной молодежной научной школе-конференции «Современные проблемы физики и технологий» (Москва, 2015); Научной сессии НИЯУ МИФИ-2015» (Москва, 2015); III межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика и лечение анемий в XXI веке» (Рязань, 2015). Работа была представлена на межлабораторном семинаре Федерального государственного учреждения «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук» 26 декабря 2016 г.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, состоящий из 4 разделов, описание материалов и методов исследования, главу «Результаты и их обсуждение», состоящую из 4 разделов, заключение, выводы, список цитируемой литературы.
Работа изложена на 151 страницах, иллюстрирована 52 рисунками, включает 9 таблиц. Список литературы состоит из 350 источников.
Сокращения, принятые в тексте. MG — метилглиоксаль, NO — оксид азота, metHb,
oxyHb, HbNO, Hb-[Fe =O], MBHb — окисленный, оксигенированный, нитрозилированный, оксоферрил- и мембраносвязанный гемоглобин, GSNO — нитрозоглутатион, Сys-NO -нитрозоцистеин, ДНКЖ-GS — ДНКЖ с глутатионовыми лигандами, ДНКЖ-PO4 — ДНКЖ с фосфатными лигандами, PAPA/NO и DETA/NO — синтетические доноры NO, СОД -супероксиддисмутаза, МТТ — дифенилтетразолий бромид.
Потенциальное использование мембраносвязанного гемоглобина в клинико-биохимической диагностике
Долгое время считалось, что главным свойством белков гемоглобинового типа является способность переносить кислород и участвовать в процессе дыхания. По этой причине гемоглобин получил название «дыхательный пигмент». К настоящему времени накоплено достаточное количество экспериментальных фактов, свидетельствующих о том, что способность обратимо связывать кислород не для всех гемоглобинов является основной функцией. Обнаружение белков гемоглобинового типа у представителей всех царств живой природы заставило переосмыслить эволюцию и функции этих белков.
Первой установленной для гемоглобинов была кислородпереносящая и кислородзапасающая функция. Оксид азота рассматривали как ещё одно химическое вещество, способное прочно связываться с гемовой группой [Иржак, 1975]. И только после того, как стало известно, что NO является сигнальной молекулой, регулирующей деятельность сердечно-сосудистой, нервной и иммунной систем [Hill et al., 2010], началось тщательное исследование реакций взаимодействия Hb с NO. Уже нет сомнений, что взаимодействие с оксидом азота (NO) — это первичная и всеобщая функция всех известных гемоглобинов, а обратимо связывают кислород далеко не все представители этого суперсемейства [Tejero, Gladwin , 2014].
Функции оксид азота в биологической системе разнообразны. С одной стороны, NO регулирует важные физиологические процессы, а с другой, NO и его метаболиты могут инактивировать структурные белки, ферменты и нуклеиновые кислоты. Оксид азота является физиологически активной молекулой благодаря способности образовывать нитрозильные комплексы с гемовым и негемовым железом и осуществлять реакцию нитрозилирования и, возможно, нитрования (через интермедиаты — NO2 и ONOO-). Эти реакции неспецифичны и могут затрагивать не только молекулы-мишени, но и другие органические вещества. Поэтому помимо систем, производящих NO, необходимы механизмы, регулирующие его концентрацию, которая не должна выходить за пределы физиологической нормы. Существует точка зрения, что молекула NO возникла на заре эволюции живых систем в реакциях восстановления нитритов в электронтранспортных цепях [Shiva, 2013]. Поэтому оксид азота уже тогда мог быть естественным промежуточным метаболитом подобно супероксид-анион радикалу (O2-). Поскольку для борьбы с супероксидным анион-радикалом в биологических системах существуют специализированные ферменты (супероксиддисмутаза и каталаза), то, по аналогии, должны существовать и биохимические системы нейтрализации NO. И такие системы были обнаружены. У прокариот и низших эукариот — это флавогемоглобины (Fgb) [Gardner, 2005], в растениях — несимбиотические гемоглобины (Nsgb) [Perazzolli et al., 2004], у животных — нейро- и цитоглобины (Ngb, Cygb) [Gardner, 2010]. Детоксикацию NO также могут осуществлять миоглобин и эритроцитарный гемоглобин [Gardner, 2005].
В то время, когда гемоглобины были впервые обнаружены у бактерий и дрожжей, исследователи не предполагали, что эти белки эволюционно связаны с метаболизмом оксида азота. Хотя уже было известно о пероксидазных и нитритредуктазных свойствах гемоглобинподобных белков, эти реакции не связывали с гемовой простетической группой и не рассматривали как физиологически значимые. И только открытие «новых» гемоглобинов с гексакоординированным железом гема и аномально высоким сродством к кислороду (для эритроцитарного Hb P50O2=26 торр, для Mb P50O2=2-3 торр, для Ngb P50O2=7,5 торр, для Cygb P50O2=0,7-1,8 торр) [Tejero, Gladwin, 2014], заставило посмотреть на эти белки по-новому.
В настоящее время о гемоглобинах в первую очередь говорят, как о «NO-реактивных белках». Именно поэтому один из томов “Methods in Enzymology” за 2008 г был назван «Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins».
По своей способности взаимодействовать с NO гемоглобины являются уникальными белками. Описаны следующие реакции, катализируемые гемоглобинами: 1) NO-диоксигеназная реакция (NOD-реакция): O2 NO Hb–[FeII] Hb–[FeIIO2] FHb – [FeIIIO2-] Hb – [FeIII] + NO3-2) Нитритредуктазная реакция: Hb–[FeII] + H+ + NO2- Hb–[FeIII] + NO + OH 3) Нитритангидразная реакция: Hb–[FeIII] + NO2- + NO Hb–[FeII] + N2O3 4) Изомеризация пероксинитрита в нитрат: Hb-[FeIII] + ONOO Hb-[FeIII ONOO] Hb – [FeIII] + NO3-5) Денитрозилазная реакция: 2H+ 2Hb-[FeIINO] 2Hb-[FeIIINO-] 2Hb-[FeIII] + N2O + H2O 6) Восстановительное нитрозилирование: OH Hb–[FeIII] + NO Hb–[FeIIINO] Hb–[FeII] + NO2-+ H+ 7) Окисление нитрита: 4Hb–[FeIIO2] + 4NO2- + 4H+ 4Hb-[FeIII] + NO3- + O2 + 2H2O 8) Окислительное денитрозилирование: Hb-[FeIINO] + O2 Hb-[FeIII] + NO3 NOD-реакция (реакция 1) является наиболее распространенной в природе реакцией гемовой группы глобинов с NO, а для некоторых гемоглобинов, например, для Fgb, эта реакция является основной функцией белка [Gardner, 2005]. Благодаря NOD-реакции внеклеточного Hb снижается концентрация NO в кровеносном русле и, как следствие, происходит вазоконстрикция и тромбообразование. Следующей по значимости является нитритредуктазная реакция (реакция 2). Общепризнано значение этой реакции для поддержания необходимого уровня NO в кровотоке в условиях гипоксии. Скорость нитритредуктазной реакции линейно зависит от концентрации протонов в среде, что указывает на участие в реакции азотистой кислоты (HNO2) и не NO2- [Doyle et al., 1981]. Конечными продуктами является Hb–[FeIII] и Hb–– [FeIINO], образуемые в соотношении 1:1 [Huang et al., 2005]. В анаэробной среде реакция восстановления нитритов deoxyHb описывается сигмоидной кривой, которая указывает на наличие аллостерического механизма. Образующийся в ходе реакции Hb–[FeIINO] смещает R—T равновесие в сторону более каталитически активного (в 50 раз) R-конформера [Huang et al., 2005]. Согласно расчетам, максимальный выход NO имеет место в условиях, когда гемоглобин наполовину насыщен кислородом [Helms, Kim-Shapiro, 2013]. Реакция окисления нитрита дезоксигемоглобином (реакция 7) представляет интерес с токсикологических позиций, поскольку протекает в крови при нитратно-нитритных интоксикациях. Несмотря на длительную историю изучения, механизм этой реакции до конца не ясен. Ясно только, что это многоэтапный процесс, сопровождающийся образованием промежуточных продуктов: H2O2 и NO2 [Keszler et al., 2008]. Как видно из представленных выше реакций, гемоглобины взаимодействуют с NO и его метаболитами во всех окислительно-восстановительных состояниях, что является косвенным подтверждением эволюционной связи гемоглобинов с метаболизмом оксида азота.
Гемоглобины также образуют различные комплексы с NO: с участием железа гемовой группы — нитрозилHb (гем-[FeIINO]), с участием SH-группы Cys-93 — нитрозоHb (SNO-Hb) [Jia et al., 1996; Doctor et al., 2005] и динитрозильные комплексы железа — Hb-ДНКЖ [Тимошин с соавт., 2007; Timoshin et al., 2007; Shumaev et al., 2008a,b].
Многообразие способов взаимодействия гемоглобинов с NO и его метаболитами служит для поддержания баланса NO и O2 в живых системах. Благодаря способности гемоглобинов формировать гемовые комплексы с NO при наномолярных концентрациях лиганда и с O2 при миллимолярных концентрациях, становится возможным регулирование концентрации оксида азота в зависимости от концентрации кислорода. Помимо NOD-реакции, в настоящее время в регулировании соотношения [NO]/[O2] в кровотоке уделяется большое внимание нитритредуктазной реакции гемоглобинов. Несмотря на то, что константа скорости восстановления нитритов дезоксигемоглобином низкая, существует точка зрения, что эта реакция может быть дополнительным путем образования NO у млекопитающих в условиях гипоксии, когда ингибируется деятельность NO-синтаз [Huang et al., 2005; Gladwin et al., 2006; Shiva, 2013]. Концепция нитритзависимой вазодилатации в настоящее время признается многими исследователями, хотя ключевая роль эритроцитарного Hb в этом процессе до сих пор оспаривается. Время реакции oxyHb и deoxyHb с NO исчисляется микросекундами (диффузионно контролируемыми константами (k 107 M-1с-1) [Gardner, 2005], в то время как восстановление NO2-дезоксигемоглобином длится от минут до часов (k 5 M-1с-1). Из этого следует, что большая часть образующегося из нитритов NO будет немедленно окислена оксигемоглобином или прочно связана с гемовым железом deoxyHb. По этой причине физиологическое значение нитритредуктазной реакции, катализируемой deoxyHb, ставится под сомнение. В работе [Helms, Kim-Shapiro, 2013] предпринята попытка разрешить этот парадокс. Следует, однако, отметить, что вазорелаксирующее действие нитритов сохраняется в условиях отсутствия эритроцитов [Dalsgaard et al., 2007]. Поэтому наиболее вероятно образование NO при участии иных нитритредуктазных систем (ксантиноксидазы, ферментов дыхательной цепи), а роль гемоглобина заключается в регулировании направления метаболических потоков оксида азота в зависимости от кислородного статуса клетки [Shiva, 2013; Tejero, Gladwin, 2014]. Предложенная в 1996 г. Stamler ом гипотеза об участии cys93 в регуляции сосудистого тонуса (SNO-Hb -гипотеза) [Jia et al., 1996; Stamler, 2004; Stamler et al., 2008] хорошо дополнила концепцию нитритзависимой вазодилатации. Суть этой гипотезы заключается в том, что механизмы, регулирующие аллостерическое связывание кислорода в молекуле гемоглобина, одновременно регулируют высвобождение оксида азота из нитрозоHb (SNO-Hb) (рис. 2).
Эксперименты с суспензией эритроцитов
Начиная с 1990-х годов в научной литературе появился термин «карбонильный стресс». Под карбонильным стрессом подразумевают возникновение дисбаланса между образованием активных карбонильных соединений (АКС) и их удалением. К активным карбонильным соединениям относят альдегиды и кетоны, которые содержат электрофильный углерод карбонильной группы, способный вступать в реакцию с нуклеофильным азотом аминогруппы аминокислот и пептидов с образованием N замещенных гликозиламинов (оснований Шиффа), которые подвергаются перегруппировке Амадори с образованием кетозаминов [Rabbani, Thornalley, 2012]. На более поздних стадиях реакции продукты Амадори подвергаются множественной дегидратации, образуя желто-коричневые продукты, получившие название конечных продуктов гликирования (КПГ, AGEs — Advanced Glycation End products). КПГ представляют группу химических соединений различного строения, включая производные пиррола, пиразина, имидазола и фурана. В научной литературе также можно встретить термин «glycation stress», обозначающий весь спектр последствий избыточного образования АКС [Ichihashi et al., 2011]. Взаимодействие между карбонильными и аминосоединениями получило название реакции Майяра (Maillard reaction). В литературе также можно встретить название «сахароаминная реакция». Louis Camille Maillard — французский биохимик и врач, в 1912-1916 гг. опубликовал несколько статей по химии взаимодействия восстанавливающих сахаров с аминокислотами и вошел в историю науки как первооткрыватель сахароаминной реакции [Maillard, 1912]. На протяжении достаточно длительного периода реакция Майяра была предметом интереса пищевой химии, поскольку температурная обработка продуктов питания ускоряет взаимодействие между сахарами и аминами. В результате этой реакции приготовленная пища приобретает цвет, вкус и аромат. Однако Майяр смотрел на сахароаминную реакцию не как пищевой химик, а как биохимик. Дело в том, что эта реакция протекает в широком диапазоне условий, в том числе в физиологических. Французский ученый, изучая химию сахароаминных взаимодействий, предполагал, что эти процессы могут протекать и в организме человека. Этой точки зрения придерживались и наши соотечественники биохимики С.П. Костычев и его сотрудница В.А. Бриллиант-Лерман, которые при добавлении глюкозы и сахарозы к дрожжевому автолизату обнаружили образование новых азотистых соединений, окрашивающих раствор в темно-бурый цвет. Коричневые пигменты были идентифицированы как продукты сахароаминной реакции, протекающей неферментативно в дрожжевых автолизатах [Костычев, Бриллиант, 1916]. В статье, опубликованной в Известиях Императорской академии наук в 1916 г. С.П. Костычев и В.А. Бриллиант-Лерман писали: «Таким образом, аминокислоты реагируют с сахаром даже без вмешательства ферментов.(…) При современном состоянии науки было бы, конечно, совершенно произвольным отрицание за такими свободно происходящими реакциями физиологического значения, особенно если принять во внимание, что условия необходимые для осуществления реакции между сахаром и аминокислотами, легко могут иметь место в протоплазме живых клеток, так как там вполне возможны концентрации участвующих в реакции веществ.»
Несмотря на эти прозорливые предположения, сделанные около 100 лет назад, на протяжении полувека реакция Майяра оставалась предметом изучения пищевой химии. Впервые на возможность протекания неферментативных реакций в биологических системах указал иранский ученый Rahbar [Rahbar, 1968]. Этому исследователю удалось из крови больных сахарным диабетом выделить фракцию необычного гемоглобина («abnormal fast-moving hemoglobin band»), который оказался аддуктом белка с молекулой глюкозы. В результате связывания глюкозы с N-концевым остатком валина -субъединиц HbA1 и последующей перегруппировки в 1-дезокси-1-N-валил-фруктозу образуется фракция гликированного гемоглобина, обозначаемая как HbA1с [Rahbar, 2005].
Обнаружение HbA1с открыло целое направление, связанное с изучением реакции Майяра в биологических системах, и инициировало поиск продуктов гликирования биомолекул в других тканях и жидкостях. В 2009 г. комитет, созданный Американской Диабетической Ассоциацией, рекомендовал использовать уровень HbA1с в качестве биомолекулярного маркера для диагностики сахарного диабета. Гликированный гемоглобин оказался очень надежным и полезным диагностическим показателем, поскольку каждое 1%-ное увеличение уровня HbA1с коррелирует с увеличением риска развития сердечно-сосудистых заболеваний на 15-18% [Saleh, 2015]. Гемоглобин не случайно стал первым объектом, неферментативное гликирование которого было показано в живых системах при физиологических условиях. Дело в том, что Hb — долгоживущий белок, время его нахождения в эритроците около 120±20 дней, и этого времени вполне достаточно для того, чтобы глюкоза прореагировала с аминогруппой концевого валина и образовала стабильный комплекс. Количество HbA1с отражает уровень глюкозы в крови за период 4-6 недель [Rahbar, 1968; Gopalkrishnapillai et al., 2003], в то время как обычный анализ глюкозы в крови показывает ее концентрацию на момент измерения, которая может быть никак не связана с состоянием гипергликемии.
Глюкоза не случайно была отобрана в процессе эволюции среди многих моносахаридов на роль основного метаболического топлива. Как было показано в специально проведенных исследованиях, глюкоза наименее реакционноспособна по сравнению с другими альдогексозами, что объясняется стабильностью ее кольцевой структуры, обеспечиваемой экваториальной ориентацией гидроксильных групп [Bunn, Higgins, 1981]. Именно благодаря меньшей склонности глюкозы к переходу в открытую химически активную карбонильную форму (табл. 5), стало возможным сосуществование высоких концентраций глюкозы с белками с минимальным риском возникновения необратимой ковалентной модификации.
Измерение антиоксидантной активности ДНКЖ
Известно, что железо в содержащих имидазол ДНКЖ, связано с атомами азота депротонированного имидазольного кольца [Wang et al., 2005; Tsai et al., 2009]. Кроме того, в координации ионов железа могут участвовать амино- и карбоксильная группа карнозина. Hobart с соавт. показали, что имидазольные группы гистидина и карнозина стабилизируют аддукты, возникающие в реакции их аминогрупп с гликированными белками [Hobart et al., 2004]. В связи с этим вероятно, что взаимодействие метилглиоксаля с гистидином может влиять на хелатирующие свойства не только аминогруппы, но и близко расположенных карбоксильной и имидазольной групп. В работе [Battah et al., 2002] был идентифицирован один из продуктов реакции метилглиоксаля с карнозином — N-лактоил-карнозин. Этот аддукт образуется в результате присоединении метилглиоксаля к имидазольному кольцу дипептида. Однако подобная модификация карнозинового лиганда должна приводить к изменению ЭПР спектра ДНКЖ.
Предполагают также, что карнозин перехватывает дикарбонильные соединения с образованием димерных продуктов, таких, как перекрестно-сшитые основания Шиффа [Reddy et al., 2005]. Нами показано, что при взаимодействии карнозина и метилглиоксаля образуется продукт с максимумом поглощения при 334 нм (рис. 20), который характерен для азометиновой группы [Yim et al., 1995; Zhou et al., 1999].
Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что перекрестно-сшитые основания Шиффа, представляющие собой продукт взаимодействия аминогрупп двух молекул карнозина с карбонильными группами метилглиоксаля, являются более эффективным лигандом при формировании ДНКЖ, чем индивидуальный карнозин (рис. 21). Действительно, метилглиоксаль не оказывает заметного влияния на образование карнозиновых ДНКЖ в присутствии фосфатных ДНКЖ. В этом случае быстрое формирование связанных с карнозином динитрозильных комплексов железа, по-видимому, обусловлено замещением фосфатных лигандов имидазольной группой дипептида. Более медленный синтез карнозиновых ДНКЖ, происходящий в присутствии HNO/NO–, но не нейтрального NO, может сопровождаться образованием не детектируемых ЭПР интермедиатов, включающих нитроксильный анион и/или имидазолат-анионы. Влияние метилглиоксаля на кинетику образования ДНКЖ с карнозином в качестве лиганда. 1 — HEPES (pH 7,6), 100 мМ карнозина, 1 мМ FeSO4, 5 мМ соли Ангели; 2 – то же, что (1) плюс 50 мМ метилглиоксаля; 3 – то же, что (1) плюс 100 мМ метилглиоксаля.
Необходимо отметить, что в условиях, моделирующих карбонильный стресс и диабетическую гипергликемию, метилглиоксаль вызывает продукцию супероксида и других активных форм кислорода [Yim et al., 1995; Rosca et al., 2005; Kang, 2005; Wu, 2005, Шумаев с соавт, 2009]. Ранее было показано кооперативное антиоксидантное действие тиолсодержащих ДНКЖ и их компонентов [Шумаев с соавт., 2004, 2006; Shumaev et al., 2008b]. Аналогичных свойств можно ожидать и от карнозиновых ДНКЖ, так как и карнозин и оксид азота могут перехватывать свободные радикалы. Поэтому на следующем этапе наших исследований было изучено антиоксидантное действие карнозиновых ДНКЖ в сравнении с их компонентами и продуктами реакции Майяра (рис. 22).
Кинетика образования продуктов взаимодействия метилглиоксаля и карнозина. Спектры поглощения реакционной среды, содержащей метилглиоксаль (50 мМ) и карнозин (100 мМ) в HEPES буфере (0,2 M) при pH 7,6.
Антиоксидантную активность оценивали по скорости восстановления оксоферрильной формы миоглобина (MbIV=O). Из данных, представленных на рис. 22, видно, что карнозиновые ДНКЖ (рис. 22, столбцы 10 и 11) наряду с фосфатными обладали наибольшей антиоксидантной активностью в данной модельной системе. Антиоксидантное действие карнозиновых ДНКЖ так же, как и других ДНКЖ, отчасти обусловлено их способностью связывать Fe2+. Ионы металлов переменной валентности играют важную роль в модификации и деструкции биополимеров в ходе неферментативного гликирования и гликоокисления [Voziyan et al., 2003; Kang, 2005; Reddy et al., 2005; Goodarzi et al., 2006]. Однако в настоящее время не показана способность карнозина образовывать комплексы с Fe2+и Fe3+ [Decker et al., 1992]. С этим фактом, вероятно, связана меньшая эффективность карнозина как антиоксиданта при иницированном ионами железа свободнорадикальном окислении липосом в сравнении с окислением, инициированным ионами меди, которые эффективно хелатируются карнозином [Baran, 2000; Decker et al., 2000].
Взаимосвязь между уровнем мембраносвязанного гемоглобина и устойчивостью эритроцитов
Известно, что изменение состояния эритроцитов отражает функциональное состояние системы крови, которое в свою очередь связано с определенным состоянием организма в условиях нормы и патологии. Изменение морфофункциональных свойств эритроцитов происходит под влиянием физической нагрузки, гипоксии, эндотоксинов, фармакологических препаратов. В настоящее время предлагается рассматривать реактивность эритроцитов в качестве индикатора стрессового состояния или адаптационной реакции организма [Гусев, Уразов, 2008; Яхно, 2011]. Существуют разные способы оценки реактивности эритроцитов: по устойчивости суспензии эритроцитов к окислительному или осмотическому гемолизу, по электрофоретической подвижности клеток [Шурхина с соавт., 2014], по реактивности плазматических мембран, по липидному составу мембран. В качестве примера можно привести работу [Зайцева с соавт., 2004], в которой сообщается о существовании нескольких адаптивных вариантов эритроцитов с различной реактивностью клеточных мембран. Можно предложить использовать содержание MBHb в качестве еще одного достаточно простого критерия для оценки реактивности эритроцитов.
Интересные данные о потенциальной возможности использования MBHb в гематологической практике содержатся в заявке на патент [Пивоваров с соавт, 2008]. Авторы патента предложили использовать данные о содержании мембраносвязанного Hb для расчета коэффициента, позволяющего оценить устойчивость эритроцитов к функциональной нагрузке — тканевой гипоксии. Расчетный коэффициент представляет собой среднее из четырех показателей (metHb, MBHb, содержание окисленных нуклеотидов, суммарная оптическая плотность), каждый из которых представлен разницей величин после и до проведения функциональной пробы. Анализ приведенных в заявке примеров показал, что наибольший вклад в величину коэффициента устойчивости эритроцитов к ишемии вносит MBHb.
Таким образом, на основании приведенных выше и других содержащихся в литературе примеров можно рассматривать уровень MBHb в эритроцитах как интегральный показатель адаптационных процессов, состояния напряженности функциональных систем организма в ответ на различные внешние воздействия.
Руководствуясь точкой зрения, что уровень мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах может быть индикатором функционального состояния клеток, можно заключить, что отклонение уровня MBHb от нормальных значений является комплексным показателем воздействия токсинов и окислителей на мембрану и внутриклеточные белки. Чтобы биохимический параметр служил в качестве диагностического маркера, он должен коррелировать с определенными патологическими процессами.
В литературе содержатся противоречивые сведения о роли МBHb в формировании устойчивости эритроцитов к гемолизу. По данным одних авторов, связывание Hb с компонентами мембраны является компенсаторно-приспособительным процессом, направленным на стабилизацию мембраны эритроцита [Knutton et al., 1970; Mendanha et al., 2012]. По другим данным, отмечена положительная корреляция между уровнем гемолиза и содержанием МBHb [Luneva et al., 2016]. Разрешить это противоречие возможно, если принять во внимание тот факт, что связываться с мембраной Hb может разными способами и в разной степени. Так, например, было показано линейное увеличение ковалентно связанного МBHb в зависимости от концентрации H2O2 [Sharma, Premachandra, 1991; Rocha et al., 2009; Mendanha et al., 2012]. Следует особо отметить, что уровень гемолиза не линейно зависит от выраженности окислительного стресса [Mendanha et al., 2012], поэтому наблюдаемый в эксперименте эффект во многом будет определяться используемой дозой окислителя. Для того, чтобы понять, как оба параметра, устойчивость и доля МBHb, связаны между собой, мы провели две серии экспериментов. В первой серии мы изучали дозозависимый гемолиз эритроцитов, индуцированный хлорноватистой кислотой (HOCl/OCl-). Хлорноватистая кислота является предшественником свободных радикалов и важнейшей составляющей бактерицидной системы организма человека и животных [Панасенко с соавт., 2013]. Кривые, отражающие изменение уровня гемолиза (оценивали по Hb в растворе — SHb (soluble Hb)) и МBHb, были представлены на одном графике (рис. 34). Видно, что одна кривая является как бы зеркальным отражением другой. Такой характер взаиморасположения кривых указывает на существование связи между двумя параметрами. Колебаниям МBHb в диапазоне концентраций 3,3 – 4,25% (обозначен штриховкой) соответствует область повышенной устойчивости клеток к гемолизу (снижение SHb). Возрастание гемолиза, превышающего контрольный уровень, сопровождается снижением МBHb.
Взаимосвязь между уровнем MBHb (красная кривая) и гемолитической устойчивостью (черная кривая) эритроцитов при действии возрастающих концентраций HOCl на суспензию эритроцитов. Штриховкой выделена область значений MBHb, соответствующих норме. Каждая точка — среднее из трех опытов. На следующем этапе была проведена серия экспериментов с суспензией отмытых эритроцитов, полученных из цельной крови пациентов РОНЦ РАМН, получавшие лечение химиотерапевтическими препаратами. Отмытые от компонентов плазмы эритроциты инкубировали в присутствии HOCl/OCl- в течение 20 мин, и затем в пробах определяли степень гемолиза по концентрации вышедшего в раствор Hb (SHb) и уровень МBHb по описанной выше методике. В зависимости от образца были получены различные пары значений для SHb и МBHb, которые ранжировали в порядке увеличения МBHb. В ходе анализа полученных данных была выявлена зависимость между степенью окислительного гемолиза эритроцитов и уровнем МBHb, которая имела сложный нелинейный характер. На кривой зависимости SHb от МBHb (рис. 35), можно выделить пять концентрационных диапазона МBHb: 1 — до 0,7%; 2 — 0,7-2,2%; 3 –2,3-3,3%; 4 — 3,3-4,9% и 5 — от 4,9%. Второму (0,7-2,2%) и четвертому (3,3-4,9%) диапазону соответствует степень гемолиза, не превышающая уровень, допустимый для эритроцитарных суспензий в искусственных средах (рис. 35, заштрихованная область).
источник