спектрофотометрический метод определения гемоглобина

Работа № 4. Определение содержания гемоглобина спектрофотометрически

Для определения гемоглобина используется гемоглобинцианидный метод. Принцип метода состоит в том, что к крови добавляется специальный трансформирующий раствор, содержащий сильный окислитель (цианид), при взаимодействии с которым эритроциты разрушаются, гемоглобин выходит в раствор и образует окрашенное соединение гемоглобинцианид. Интенсивность окраски пропорциональна количеству гемоглобина и фиксируется на спектрофотометре.

Ход работы. В пробирку пипеткой перенесите 5 мл трансформирующего раствора. Выпустить 0,02 мл крови в трансформирующий раствор. Раствор крови в трансформирующем растворе аккуратно, но тщательно перемешайте и оставьте на 10-15 мин при комнатной для полного развития окраски (раствор остается стабильным в течение более 24 ч). Таким же образом подготовьте пробу со стандартным раствором гемоглобина: 5 мл трансформирующего раствора и один капилляр стандартного раствора гемоглобина (120 г/л).

Далее производят измерение оптической плотности на спектрофотометре опытной и стандартной проб при длине волны 520-560нм (зеленый светофильтр) в кювете толщиной 10мм. Предварительно выставляется ноль по трансформирующему раствору.

Рассчитывают коэффициент по формуле:

130 – концентрация гемоглобинцианида в калибраторе в пересчете на гемоглобин, E – оптическая плотность калибратора гемоглобинцианида. При использовании спектрофотометра определение оптической плотности проводят при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10мм. Содержание гемоглобина рассчитывают по формуле:

Hb (г/л) = E опыт хК,

где E опыт – оптическая плотность раствора.

Рекомендации к оформлению работы.Рассчитать содержание гемоглобина в крови. Сравнить с нормой.

Работа № 5. Расчёт цветового показателя.

Цветовым показателем (ЦП)называютусловную величину, характеризующую степень насыщения гемоглобином каждого эритроцита. Этот показатель можно вычислить, зная содержание гемоглобина в исследуемой крови и количество эритроцитов в 1 мкл этой же крови.

ЦП = Нв (г/л) * 3 / (три первых цифры от числа эритроцитов)

Рекомендации к оформлению работы.В норме цветовой показатель равен 0,85 — 1,15 — нормохромазия.

Превышение ЦП верхнего предела нормы называют гиперхромазией, уменьшение за предел нижнего уровня нормы — гипохромазией.

Работа № 6.Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

Ход работы. капилляром из прибора Панченкова набрать из флакона 5,0%-ный раствор цитрата натрия до метки 50 (Р) и выпустить раствор на часовое стекло.

Погрузить во флакон с кровью кончик капилляра и, наклоняя капилляр, набрать в него (без пузырьков воздуха) кровь до метки О (К). Затем выпустить кровь в раствор цитрата натрия на часовое стекло. Повторить забор крови из флакона до метки О (К) и эту порцию тоже выпустить на часовое стекло. Таким образом, соотношение цитрата натрия и крови на часовом стекле равно 1:4. Быстро перемешать кровь стеклянной палочкой на часовом стекле. Наклоняя капилляр, набрать в него смесь крови с цитратом натрия до метки О (К), закрыть пальцем верхний конец капилляра, чтобы раствор крови не вытек. Упереть нижний конец капилляра в нижнее резиновое кольцо прибора Панченкова и затем вставить верхний конец капилляра в резиновое кольцо сверху.

Рекомендации к оформлению работы.Отметить время и ровно через час посмотреть, какова высота столбика прозрачной плазмы, т.е. на сколько миллиметров за 1 час осели эритроциты.

Работа № 7.Определение осмотической резистентности эритроцитов.

Ход работы. В штатив поместить 10 пробирок и пронумеровать их маркером. В каждую пробирку налить 1,0% раствор хлорида натрия (NаCl) в убывающем количестве от 1,2 до 0,3 мл. Для приготовления растворов различной концентрации в каждую пробирку добавить дистиллированную воду согласно таблице, а затем по две капли консервированной крови.

Содержимое пробирок осторожно перемешать и оставить стоять в течение 1 час при комнатной температуре. После этого отметить, в какой пробирке обнаруживается начальный и конечный гемолиз эритроцитов. О начале гемолиза свидетельствует прозрачность раствора, об его окончании – отсутствие осадка эритроцитов. Концентрации растворов в этих пробирках и является показателем осмотической резистентности эритроцитов.

Максимальная стойкость эритроцитов или нижнее значение осмотической резистентности находится в пределах 0,30 – 0,25

Минимальная стойкость эритроцитов или верхнее значение осмотической резистентности колеблется в пределах 0,45- 0,40.

Полученные результаты в виде условных обозначений («-» — гемолиз отсутствует; «+» — гемолиз полный; « + -» — гемолиз частичный) разместить в таблице.

Дата добавления: 2018-06-27 ; просмотров: 321 ;

источник

Спектрофотометрический анализ основных производных гемоглобина в присутствии сульфгемоглобина Текст научной статьи по специальности « Прочие медицинские науки»

Похожие темы научных работ по прочим медицинским наукам , автор научной работы — Е. В. Бескровная, Е. Ю. Мосур, И. А. Пильщикова, Н. А. Семиколенова

Five general derivates of hemoglobin (HbO2 , Hb, HbCO, MetHb, SulfHb) has been measured by multicomponent method in current study. Some samples with increased level of SulfHb by 4% has been observed. The dynamics of the absorbance spectra of blood from degree of saturation by H2S has been investigated.

Текст научной работы на тему «Спектрофотометрический анализ основных производных гемоглобина в присутствии сульфгемоглобина»

Вестник Омского университета, 2005. № 2. С. 38-40.

© Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, И.А. Пилыцикова, УДК 543.42.062:616.5

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОСНОВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕМОГЛОБИНА В ПРИСУТСТВИИ СУЛЬФГЕМОГЛОБИНА

Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур*, И.А. Пилыцикова, Н.А. Семиколенова**

* Омский филиал Института физики полупроводников СО РАН

644077, Омск, пр. Мира, 55а, ** Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского, кафедра микроэлектроники и медицинской физики (¡44077, Омск, пр. Мира, 55а

Five general derivates of hemoglobin (HbO-2 , Hb, HbCO, MetHb, SulfHb) has been measured by multicomponent method in current study. Some samples with increased level of SulfHb by 4% has been observed. The dynamics of the absorbance spectra of blood from degree of saturation by H2S has been investigated.

Изучение патологических состояний организма человека на современном уровне, повышение качества диагностики невозможно без внедрения в клиническую практику методов определения дисфункциональных (не участвующих в транспорте кислорода) производных гемоглобина, в том числе сульфгемоглобина.

Известно, что гемоглобин под влиянием некоторых реакций окисления может превращаться в зеленый пигмент, названный вердоглобином. В настоящее время известны 5 типов вердоглоби-нов: вердоглобин А (холеглобин), вердоглобин^дг, вердоглобинрЯ, вердоглобинNO и вердоглобин S (сульфгемоглобин).

Особенный интерес для исследователей представляет сульфгемоглобин (SulfHb) — единственный из вердоглобинов, который накапливается в значительных количествах в крови при ряде заболеваний. Содержание SulfHb в крови здоровых людей очень мало и не превышает 1 %.

Хотя точное строение вердоглобинов пока не известно, установлено, что эти пигменты состоят из нативного глобина и простетической группы (верда) — железопорфиринового комплекса. В верде, в отличие от гема, раскрыто порфириновое кольцо вследствие окисления а-метинового мостика. Считается, что в SulfHb атом серы связан с парой /3-пиррольных атомов углерода, расположенных на периферии хлоринолового кольца, образовавшегося при насыщении данной /3- /3 двой-

ной связи протопорфирина IX гемоглобина [1]. Подобная структура объясняет значительные отличия спектра поглощения сульфгемоглобина от спектров поглощения других производных гемоглобина, а также очень низкое сродство SulfHb к кислороду [2].

Вердоглобины — продукты необратимого окисления гемоглобина — не участвуют в транспорте кислорода, поэтому их можно отнести к группе дисгемоглобинов. Все эти вещества получены в эксперименте in vitro, они образуются при реакции гемоглобина и сероводорода (H2S). In vivo, наличие SulfHb объясняется тем, что сероводород производится кишечными бактериями и в результате аутоинтоксикации всасывается в кровь. Имеется достаточно оснований предполагать, что в физиологических условиях окисление гемоглобина в вердоглобины является обычным этапом в процессе образования желчных пигментов.

Источником H2 S для образования SulfHb может служить не только кишечник, но и сами эритроциты, содержащие повышенное количество восстановленного глютатиона (Г-Н). Предполагается, что при избытке Г-Н происходит реакция:

2Г-Н + НАДФ Г»редуктаза 2Г + НАДФ — Н2. (1)

Накапливающийся при этом окисленный глюта-тион (Г) разрушается с образованием сероводорода.

Содержание SulfHb в крови выше нормы мо-

Спектрофотометрический анализ основных производных гемоглобина.

жет наблюдаться при отравлениях сероводородом, бромом, различными соединениями сурьмы, нитратами, анилином и его производными, а также вследствие приема таких лекарственных препаратов, как ацетанилид, сульфонамид, фенаци-тин [3].

В лаборатории биофизики ОмГУ разработан метод определения содержания основных производных гемоглобина (дезоксигемоглобина (НЬ), оксигемоглобина (НЪ02), карбоксигемоглобина (НЬСО) и метгемоглобина (МеШЬ)) в крови, основанный на многокомпонентном анализе спектров поглощения крови и ее растворов [4; 5].

Целью данной работы является: расширение числа производных, определяемых с помощью многокомпонентного метода — наряду с основными производными устанавливается концентрация сульфгемоглобина; исследование динамики содержания основных производных гемоглобина при насыщении крови сероводородом.

В настоящей работе использовались образцы ге-паринизированной венозной крови, насыщенные сероводородом, полученным по стандартной методике при реакции сульфида натрия и концентрированной соляной кислоты. После насыщения крови сероводородом приготовлены 1%-ые растворы: к 20 мл дистиллированной воды добавляется 0,06 мл 0,04% раствора аммиака (для просветления раствора) и 0,5 мл крови, через 1— 2 минуты (после гемолиза) добавляется 25 мл фосфатного буфера (0,0667 М КН2РОА/0,0667 М Ыа2НРОА • 2Я20, рН = 7,2). Общий объем раствора доводится дистиллированной водой до 50 мл.

Регистрация спектров поглощения проводилась с помощью спектрофотометра СФ-56 в диапазоне длин волн 510-650 нм, оптическая длина пути 1 см. Вычисление содержания производных гемоглобина по измеренной оптической плотности производилось с помощью компьютерной программы «Нето8рес1г» [6], реализующей метод, объединяющий в единой вычислительной схеме методы линейного программирования и алгебраической коррекции фона. Данный метод позволяет выделить спектр примеси, по которому примесное вещество можно идентифицировать.

Результаты и их обсуждение

На рис. 1 приведена зависимость спектров поглощения крови от степени насыщения сероводородом.

Рис. 1. Спектры поглощения крови при различном насыщении сероводородом: жирной сплошной линией выделен исходный образец, жирной пунктирной — образец с максимальным насыщением Н2в

Количественный анализ основных производных гемоглобина показал появление в смеси производных еще одного вещества. При исследовании фонового спектра предполагалось, что неизвестное вещество — сульфгемоглобин. Для подтверждения этой гипотезы матрица миллимоляр-ных показателей поглощения (м.п.п.) дополнена м.п.п. сульфгемоглобина (рис. 2). Повторное проведение вычислений с учетом сульфгемоглобина показало обоснованность выдвинутого предположения, при этом была получена зависимость содержания оксигемоглобина, дезоксигемоглобина, карбоксигемоглобина, метгемоглобина и сульфгемоглобина от степени насыщения крови сероводородом.

Рис. 2. Зависимость миллимолярных показателей поглощения сульфгемоглобина от длины волны [7]

Данные, представленные на рис. 3, позволяют сделать вывод о том, что при постепенном насыщении крови сероводородом происходит восстановление НЬО2, так как наблюдается уменьшение содержания НЬО^ ■ Содержание SulfHb увеличивается с 0,11 до 7,94% в результате реакции между восстановленным гемоглобином и серово-

Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, И.А. Пилыцикова, Н.А. Семиколенова

Рис. 3. Динамика содержания основных производных гемоглобина при насыщении крови сероводородом

дородом. Растет содержание MetHb в результате окисления железа гемоглобина до трехвалентного состояния, вызванного Но S. Небольшой рост содержания НЬСО обусловлен деструкцией гемоглобина. При разрушении гемоглобина образуется моноокись углерода, которая связывается гемоглобином с образованием карбоксигемоглоби-на.

При серийном анализе образцов крови пациентов МСЧ №7 г. Омска обнаружены образцы с повышенным содержанием SulfHb. Количественный анализ показал, что в этих образцах содержание SulfHb достигает 4%. Патофизиология SulfHb такова, что содержание равное 4% вызывает цианоз, эквивалентный цианозу при 12% MetHb. Предположительно, такую реакцию могли вызвать лекарственные препараты класса сульфониламидов.

2. Исследована динамика содержания производных гемоглобина при насыщении крови сероводородом.

3. Количественный анализ образцов крови пациентов МСЧ №7 выявил образцы с повышенным содержанием сульфгемоглобина, что подтверждает необходимость клинического внедрения методики.

[1] Dijkhuizen P., Buursma A., Gerding A.M., Zijlst-ra W. G. Sulfhemoglobin. Absorption spectrum, millimolar extinction coefficient at e=620 nm, and interference with the determination of haemiglobin and of haemiglobincyanide // Clin. Chem. Acta. 1977; 78: 479-487.

[2] The reversible binding of oxygen to sulfhemoglobin //J. Biol. Chem. 1978; 253: 7212-5.

[3] Kneezel L.D., Kitchens C.S. Pheiiacetin-induced sulfhemoglobinemia: Report of a case and review of the literature // Johns Hopkins Med. J. 1976; 139: 175-7.

[4] Пат. 2140083 Ru, МПК6 С 01 N 33/52, 33/72. Способ определения содержания основных производных гемоглобина / Адамов С.А., Александрова С.А., Мосур Е.Ю., Семиколенова Н.А. (Россия); Омский государственный университет (Россия). № 98101662/14; заявл. 29.01.98; опубл. 20.10.99. Бюл. №29.

[5] Адамов С.А., Александрова С.А., Денисов А.Н., Мосур Е.Ю., Семиколенова Н.А. Спектрофото-метрический количественный анализ основных дериватов гемоглобина // Биохимия. 1998. Т. 63. № 10. С. 1362-1366.

[6] Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ «HemoSpectr» №2001610571, Мосур Е.Ю. (Россия); Омский государственный университет (Россия). № 2001610305; заявл. 19.03.01; Зарегистрировано в Реестре программ для ЭВМ 17.05.01.

[7] Zivart A., Buursma A., Van Катреп E.J., Zijlst-ra W. G. Multicomponent analysis of hemoglobin derivatives with a reversed-optics spectrophotometer // Clin. Chem. 1984; 30: 373-9.

1. Число производных гемоглобина, содержание которых определяется при помощи разработанного метода, расширено. Наряду с основными производными возможно исследование сульфге-

источник

Спектрофотометрический метод определения содержания основных производных гемоглобина Мосур Евгений Юрьевич

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ‘, MOUSEOFF, FGCOLOR, ‘#FFFFCC’,BGCOLOR, ‘#393939’);» onMouseOut=»return nd();»> Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Мосур Евгений Юрьевич. Спектрофотометрический метод определения содержания основных производных гемоглобина : диссертация . кандидата физико-математических наук : 01.04.01 / Мосур Евгений Юрьевич; [Место защиты: Алт. гос. ун-т].- Омск, 2007.- 118 с.: ил. РГБ ОД, 61 07-1/1216

Глава 1. Оптические свойства гемоглобина. Исследование газотранспортных функций эритроцитов по спектрам поглощения (литературный обзор)

1.1. Гемоглобин. Структура, функции, оптические свойства 9

1.1.1. Строение гемоглобина 9

1.1.2. Электронные и магнитные свойства гемоглобина 10

1.1.3. Процесс оксигенации гемоглобина 14

1.1.4. Оптические свойства гемоглобина 17

1.2. Методология определения параметров кислородного транспорта крови: кислородного насыщения крови, содержания производных гемоглобина 20

1.2.1. Параметры, описывающие кислородный транспорт крови; факторы, влияющие на их изменение 20

1.2.2. Карбоксигемоглобин: патофизиологическое значение, методы определения концентрации 23

1.2.3. Метгемоглобин: патофизиологическое значение, методы определения концентрации 28

1.2.5. Нитрозилгемоглобин 35

1.2.7. Методы определения параметров кислородного транспорта крови 37

Глава 2. Количественный спектрофотометрический анализ сложных многокомпонентных смесей. Новые аналитические принципы определения содержания основных производных гемоглобина

2.1. Система уравнений Фирордта 47

2.2. Методы решения переопределенных систем уравнений и их применение к количественному спектрофотометрическому анализу 49

2.2.1. Метод наименьших квадратов (МНК) 49

2.2.2. Метод алгебраической коррекции фона (АКФ) 51

2.2.3. Метод линейного программирования (МЛП) 51

2.2.4. Объединенные методы, включающие МЛП и АКФ 53

2.2.5. Сравнение количественных спектрофотометрических методов 56

2.3. Методология одновременного определения содержания основных производных гемоглобина в крови человека 57

2.3.1. Особенности количественного спектрофотометрического анализа основных производных гемоглобина 57

2.3.2. Поверка шкалы оптической плотности спектрофотометра 58

2.3.3. Выбор аналитических длин волн 59

2.3.4. Выбор метода количественного анализа основных дериватов гемоглобина. Компьютерная программа «HemoSpectr» 60

2.3.5. Тестирование метода МЛП+АКФ на многокомпонентных смесях 60

2.3.6. Методика определения миллимолярных показателей поглощения основных производных гемоглобина 62

2.3.7. Оценка данных, получаемых при количественном анализе основных производных гемоглобина разработанным методом, с помощью независимых методов 65

Глава 3. Исследование «in vitro» влияния на газовый состав гемоглобина различных факторов: УФ-излучения, у-излучения, химических веществ

3.1. Методика эксперимента 68

3.2. Сравнение спектров поглощения цельной крови и ее растворов 69

3.3. Температурная зависимость спектров поглощения крови 70

3.4. Анализ основных производнъа гемоглобина в крови здоровых доноров 71

3.5. Исследование динамики содержания основных производных гемоглобина при воздействии на кровь различных факторов: оксигенации, моноокиси углерода, окислител

3.5.2. Моноокись углерода 72

3.6. Анализ основных производных гемоглобина в присутствии примеси (сульфгемоглобжа) 11

3.7. Количественный спектрофотометрический анализ основных производных гемоглобина при воздействии УФ-излучения на цельную кровь 79

3.8. Количественный спектрофотометрический анализ основных производных гемоглобина при воздействии у-излучения на растворы крови 83

Глава 4. Применение разработанного метода к диагностике патологических состояний с последующим статистическим анализом

4.1. Диагностика сульфгемоглобинемии 86

4.2. Определение изменений в газовом составе гемоглобина при никотиновой интоксикации 87

4.3. Количественный анализ нитрозилгемоглобина 90

4.4. Особенности газового состава гемоглобина у больных дисплазией соединительной ткани 94

4.5. Особенности газового состава гемоглобина у больных железодефщитной анемией98 Выводы 100

Список цитируемой литературы 101

Кислородный транспорт крови, составляющий основу дыхания, — важнейший физиологический процесс, который определяет жизнедеятельность всего организма человека Мониторинг параметров, описывающих этот процесс, является необходимой клинической процедурой и обязательным условием для достоверной оценки текущего состояния пациента и последующего прогноза развития критических состояний в анестезиологии, реаниматологии и интенсивной терапии

Содержание производных гемоглобина в крови — один из главных параметров кислородного транспорта крови С изменением газового состава гемоглобина связан ряд патологических состояний организма человека В настоящее время подавляющее большинство российских клиник из-за отсутствия необходимой методологической и приборной базы вынуждено ограничиваться определением общей концентрации гемоглобина

На Западе и в России производятся пульсоксиметры — приборы, служащие для определения кислородного насыщения крови Несмотря на несомненные достоинства (компактность, неинвазивность), пульсоксиметры имеют существенный недостаток, ограничивающий диапазон их применения В расчет не принимаются так называемые дисфункциональные дериваты кар-боксигемоглобин, метгемоглобин и др , которые не участвуют в транспорте кислорода Обычно их суммарное содержание невелико (1-4 %), но при патологических состояниях концентрации дисфункциональных производных гемоглобина значительно увеличиваются, и показания пульсоксиметра становятся некорректными

Западные производители выпускают в лабораторном варианте и малыми партиями, что обуславливает их очень высокую стоимость, так называемые СО-оксиметры, — приборы, способные определять содержание оксиге-моглобина, дезоксигемоглобина, карбоксигемоглобина и метгемоглобина В СО-оксиметрах вычисление содержания производных гемоглобина осуществляется методом наименьших квадратов, имеющим применительно к данной задаче ряд недостатков неприменимость к анализу образцов с неполностью известным качественным составом, появление не имеющих физического смысла отрицательных значений концентрации, получение завышенного значения общей концентрации гемоглобина В частности, указывается на неприменимость СО-оксиметров к анализу образцов крови 1) с примесью метиленового синего, используемого при лечении метгемоглобинемии, 2) с содержанием карбоксигемоглобина Спектрофотометрический метод определения содержания основных производных гемоглобина

источник