спектры поглощения гемоглобина и его соединений

Поглощение света гемоглобином

Поглощение света и цвет гемоглобина.Цвет растворенного вещества, не испускающего световые лучи, зависит от его способности поглощать падающий свет в той или иной части спектра видимого света. Как правило, каждое вещество поглощает свет лишь в определенной области спектра, тогда как свет других длин волн проходит через это вещество почти беспрепятственно. Цвет раствора вещества определяется спектральным составом прошедшего через него света.

Красный цвет растворов гемоглобина (и, следовательно, крови) обусловлен тем, что это вещество относительно сильно поглощает коротковолновый свет, т. е. в синей области спектра, а большую часть длинноволнового (красного) света пропускает.

При исследовании света, прошедшего через раствор оксигенированного гемоглобина, с помощью спектроскопа можно обнаружить не только полосу поглощения в синей области спектра (полосу Соре), но также две характерные темные полосы (полосы поглощения) в желтой и желто-зеленой областях спектра с максимумами при длинах волн 577 и 541 нм [11].

Дезоксигемоглобин несколько интенсивнее, чем оксигемоглобин, поглощает длинноволновые лучи и менее интенсивно — коротковолновые. В связи с этим венозная кровь выглядит темнее и имеет красный цвет с синеватым оттенком. При спектроскопическом исследовании выявляется одна широкая полоса поглощения в желто-зеленой части спектра с максимумом при длине волны 555 нм.

Спектрфотометрия. Для количественного анализа абсорбционных свойств окрашенного раствора используют спектрофотометры. В этих приборах видимый свет разлагается в спектр при помощи призмы или дифракционной решетки, а затем свет очень узкой области длин волн (так называемый монохроматический свет) проходит через исследуемый раствор. Поглощение света зависит от длины волны и от свойств раствора. Для определения соотношения между интенсивностью падающего (I0) и прошедшего (I) света используется фотоэлемент. Отношение I/I0 называется пропусканием, а отношение (I0 — I)/I0 — поглощением. Полный спектр поглощения раствора получают путем последовательного измерения этих величин для разных длин волн.

ГЛАВА 22. ТРАНСПОРТ ГАЗОВ КРОВИ 607

Рис. 22.4. Спектры поглощения оксигемоглобина (НbО2) и дезоксигемоглобина (Hb). По оси ординат слева-коэффициент поглощения, справа -экстинкция

Спектры поглощения.На рис. 22.4 изображены спектры поглощения оксигемоглобина ндезоксигемоглобина. Тем участкам спектра, в которых при спектроскопии обнаруживаются темные полосы, соответствуют максимумы на кривой поглощения. Для оксигемоглобина характерны два таких максимума, а для гемоглобина — один, занимающий положение между ними. Из рисунка видно, что эти максимумы приходятся на те же длины волн, что и полосы поглощения.

Точки пересечения обеих кривых поглощения, или так называемые изобестические точки, соответствуют длинам волн, при которых растворы равной концентрации Hb и НbО2 пропускают свет в одинаковой степени. Если длина волны световых лучей соответствует изобестической точке, то поглощение их гемоглобином не зависит от степени его оксигенации. Монохроматический свет такой длины волны используют в тех случаях, когда необходимо определить концентрацию гемоглобина, не подвергая его химическим модификациям (см. ниже). Если же спектрофотометрию используют для измерения насыщения гемоглобина кислородом, то, напротив, выбирают свет с такой длиной волны, при которой разница между коэффициентами поглощения оксигемоглобина и дезоксигемоглобина максимальна, т.е. 600, 577, 470 нм и т. д. (см. рис. 22.4).

Закон Ламберта-Бэра. Вкачестве количественной характеристики поглощения света часто используют также экстинкцию(Е) (на рис. 22.4 отложена по правой оси ординат):

О)

где I0-интенсивность падающего света, а I- интенсивность прошедшего света. Экстинкцию удобно использовать в связи с тем, что она прямо про-

порциональна концентрации растворенного вещества С:

(2)

где d-толщина слоя раствора, а ε — коэффициент экстинкции (величина, постоянная для каждого вещества). Линейная зависимость между экстинкцией, концентрацией и толщиной слоя раствора называется законом Ламберта-Бэра. Этот закон справедлив только для монохроматического света.

Содержание гемоглобина в крови; среднее содержание гемоглобина в эритроците

Нормальные показатели.Содержание гемоглобина в крови человека составляет в среднем 158 г/л (15.8 г/дл) у мужчин и 140 г/л (14 г/дл) у женщин. Как и практически любые биологические показатели, эта величина претерпевает определенные колебания даже у здоровых людей. Пределы колебаний определяют путем построения частотного распределениязначений для большого числа людей (рис. 22.5).

С возрастом содержание гемоглобина в крови заметно меняется. В крови новорожденного оно составляет 200 г/л. причем возможны значительные индивидуальные колебания (рис. 22.5). В течение первого года жизни содержание гемоглобина снижается примерно до 115 г/л, а затем постепенно возрастает до уровня, характерного для взрослых.

Высокое содержание гемоглобина в крови наблюдается не только у плода, но также у лиц, длительное время живущих в условиях высокогорья (с. 714). И в том и в другом случае повышение содержания гемоглобина необходимо для того, чтобы обеспечить нормальное снабжение тканей кислородом при пониженном парциальном давлении этого газа.

Уменьшение содержания гемоглобина по сравнению с нормальным уровнем называется анемией.Как правило, диагноз анемия ставят в том случае, если содержание гемоглобина меньше 130 г/л у мужчин и 120 г/л у женщин.

Измерение содержания гемоглобина.Для измерения содержания гемоглобина существует много методов, в том числе: 1) определение количества связанного О2 (1 г Hb может присоединить до 1,36 мл О2); 2) анализ уровня железа в крови (содержание железа в гемоглобине составляет 0,34%); 3) колориметрия (сравнение цвета крови с цветом стандартного раствора); 4) измерение экстинкции (спектрофотометрия). При проведении рутинных определений уровня гемоглобина отдают предпочтение последнему методу, так как при использова-

Рис. 22.5. Частотное распределение концентраций гемоглобина у взрослых мужчин ( ), взрослых женщин ( ) и новорожденных. По оси ординат — относительная частота встречаемости, по оси абсцисс — содержание гемоглобина; μ среднее значение (медиана), σ-стандартное отклонение (величина, характеризующая разброс значений; соответствует расстоянию от медианы кривой нормального распределения до значения, соответствующего наиболее крутому участку этой кривой)

нии первых двух способов необходима сложная аппаратура, а метод колориметрии неточен.

Спектрофотометрический анализ. Принцип метода состоит в определении содержания Hb в крови по экстинкции монохроматического света. Поскольку растворенный гемоглобин нестабилен, а экстинкция зависит от степени оксигенации, его необходимо предварительно перевести в стабильную форму.

Спектрофотометрические измерения содержания гемоглобина производят следующим образом. Кровь набирают в капиллярную пипетку и затем смешивают с раствором, содержащим калий железосинеродистый (K3[Fe(CN)6]), цианистый калий (KCN) и бикарбонат натрия (NaHCO3). Под действием этих веществ эритроциты разрушаются, и гемоглобин превращается в цианметгемоглобинHbCN (содержащий трехвалентное железо), способный сохраняться в течение нескольких недель. При спектрофотометрии раствор цианметгемоглобина освещают монохроматическим светом с длиной волны 546 нм и определяют экстинкцию Е. Зная коэффициент экстинкции ε и толщину слоя раствора d, можно, исходя из закона

Ламберта-Бэра [уравнение (2)], определить концентрацию раствора С непосредственно по величине экстинкции Е. Чаще предпочитают, однако, предварительно откалибровать шкалу экстинкции при помощи стандартного раствора. В настоящее время цианметгемоглобиновый метод считается наиболее точным из общепринятых способов измерения содержания гемоглобина [32].

Среднее содержание гемоглобина в эритроците.

Важным диагностическим показателем, позволяющим оценить эритропоэз и провести дифференциальную диагностику различных форм анемии, служит среднее содержание гемоглобина в одном эритроците (СГЭ) (по международной классификации-mean corpuscular hemoglobin, MCH). Эта величина отражает абсолютное количество гемоглобина, содержащееся в среднем в одном эритроците. Ее находят путем деления количества гемоглобина в определенном объеме крови на число эритроцитов в том же объеме.

Приведем пример расчета СГЭ. У здорового мужчины в 1 л крови содержится 158 г Hb и 5,1 млн ∙ 10 6 эритроцитов (1 л = 10 6 мкл). СГЭ равно отношению этих величин:

Такая же величина СГЭ характерна и для здоровых женшин:

Эритроциты с нормальным содержанием гемоглобина (26-36 пг) называют нормохромнымн. Если СГЭ патологически снижено, то эритроциты называют гипохромными, а если оно повышено — гиперхромными. Эти же термины употребляют и для обозначения различных форм анемии. Так, когда образование гемоглобина снижается в результате недостатка железа, содержание гемоглобина в расчете на эритроцит падает, и возникает гипохромная анемия. При других разновидностях анемии (например, пернициозной анемии) нарушается образование красных кровяных телец в костном мозгу, и в крови появляются деформированные эритроциты с высоким содержанием гемоглобина. В этом случае речь идет о гиперхромной анемии. После значительной кровопотери СГЭ сначала не изменяется (нормохромная анемия), а в последующем вследствие избыточной продукции эритроцитов содержание гемоглобина в них падает (гипохромная анемия).

Дата добавления: 2015-10-01 ; просмотров: 3172 . Нарушение авторских прав

источник

Гемоглобин

– перенос кислорода. Гемоглобин присоединяет кислород при высоком порциальном давлении(в легких). В молекуле гемоглобина имеется 4 гема, каждый из которых может присоединить молекулу кислорода. Оксигенация- присоединение кислорода к гемоглобину, т.к. не происходит процесс изменения валентности железа. В тканях, где низкое парциальное давление гемоглобин отдает кислород – дезоксикинация. Соединение гемоглобина и кислорода называется оксигемоглобин. Процесс оксигенации идет ступенчато.

В ходе оксигенации процесс присоединения кислорода возрастает.

Кооперативный эффект – молекулы кислорода в конце присоединяются в 500 раз быстрее. 1 г гемоглобина присоединяет 1,34 мл O2.

100% насыщение крови гемоглобином – максимальное процентное(объемное) насыщение

20мл на 100мл крови. На самом деле гемоглобин насыщается на 96-98%.

Присоединение кислорода также зависит от pH, от количества CO2, 2,3-дифософглицерат(продукт неполного окисления глюкозы). При накоплении его гемоглобин начинает легче отдавать кислород.

Метгемоглобин, в котором железо становится 3х валентным(при действии сильных окислителей-феррицианид калия, нитраты, бертолетовая соль, фенацитин) Он не может отдавать кислород. Метгемоглобин способен связывать синилистую кислоту и др. связи, поэтому при отравлении этими веществами в организм вводят метгемоглобин.

Карбоксигемоглобин(соединение Hb с CO) угарный газ присоединяется в гемоглобине к железу, но сродство гемоглобина к угарному газу выше в 300 раз, чем к кислороду. Если в воздухе больше 0,1 % угарного газа, то гемоглобин связывается с угарным газом. 60% связано с угарным газом(смерть). Угарный газ содержится в выхлопных газах, в печах, образуется при курении.

Помощь пострадавшим – отравление угарным газом начинается незаметно. Сам человек не может двигаться, необходим его вынос из этого помещения и обеспечение дыхания желательно газовым баллоном с 95% кислорода и 5 % углекислого газа. Гемоглобин может присоединяться углекислый газ – карбгемоглобин. Соединение происходит с белковой частью. Акцептором являются аминные части(NH2) – R-NH2+CO2=RNHCOOH.

Это соединение способно удалять углекислый газ. Соединение гемоглобина с разными газами обладает разными спектрами поглощения. Восстановленный гемоглобин имеет одну широкую полосу желто-зеленой части спектра. У оксигемоглобина образуется 2 полосы в желто-зеленой части спектра. Метгемоглобин имеет 4 полосы – 2 в желто-зеленой, в красной и в синей. Карбоксигемоглобин имеет 2 полосы в желто-зеленой части спектра, но это соединение можно отличить от оксигемоглобина путем добавления восстановителя. Поскольку карбоксигемоглобин соединение прочное, то добавление восстановителя не добавляет полос.

Гемоглобин выполняет важную функцию в поддержании нормального уровня pH. При отдаче кислорода в тканях гемоглобин присоединяет протон. В легких протон водорода отдается для образования угольной кислоты. При действии на гемоглобин сильных кислот или щелочей образуются соединения с кристаллической формой и эти соединения являются основанием для подтверждения крови. Гемины, гемохромогены. В синтезе парфирина(пиррольного кольца) принимают участие глицин и янтарная кислота. Глобин образуется из аминокислот путем синтеза белка. В эритроцитах, которые завершают свой жизненный цикл происходит и распад гемоглобина. При этом гемм отделяется от белковой части. От гемма отеляется железа, а из остатков гемма образуются желчные пигменты(например билирубин, который затем будет захватываться печеночными клетками) Внутри гепатоцитов происходит соединение гемоглобина с глюкуроновой кислотой. Билирубин гюкуронит выводится в желчные капилляры. С желчбю попадает в кишечник, где подвергается окислению, где переходит в урабиллин, который всасывается в кровь. Часть остается в кишечники и выводится с каловыми массами(их окраска — стеркобиллины). Уррабиллин придает окраску моче и снова захватывается печеночными клетками.

источник

СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ У ЖИВОТНЫХ
творческая работа учащихся по биологии (9 класс) на тему

Цель: Исследование спектров поглощения гемоглобина и его производных у раз-личных видов животных.

Задачи: 1)Определение содержания гемоглобина в крови животных; 2) Определение спектров поглощения оксигемоглобина, дезоксигемоглобина и метгемоглобина в крови кролика, овцы, теленка.

Скачать:

Предварительный просмотр:

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГОСУДАРСТВЕННАЯ

ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ СРЕДНЯЯ ШКОЛА № 28 Г. ВИТЕБСКА»

СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА И ЕГО

Шустова О.С., Савицкая Т.В., 9 «Б» класс

Баран В.П., кандидат биологических наук, доцент УО «Витебская ордена «Знак почета» государственная академия ветеринарной медицины»

Баран Е.Н., учитель биологии

Хвалько Н.Г., учитель физики

Цель: Исследование спектров поглощения гемоглобина и его производных у различных видов животных.

Задачи: 1)Определение содержания гемоглобина в крови животных; 2) Определение спектров поглощения оксигемоглобина, дезоксигемоглобина и метгемоглобина в крови кролика, овцы, теленка.

Гемоглобин – это глобулярный белок способный связывать и переносить молекулярный кислород. Гемоглобин является основным компонентом эритроцитов теплокровных животных. Он является основным компонентом эритроцитов высших животных. В одном эритроците содержится около 280 миллионов молекул гемоглобина, каждая из которых состоит примерно из 10 тысяч атомов водорода, углерода, азота, кислорода, серы и железа. Молекулярная масса гемоглобина человека равна 68000

Гемоглобин относят к сложным белкам, в составе которого в качестве небелковой части выступает порфириновое ядро гемма, которое связано с белком глобином. Гемм по строению одинаков у различных видов животных, а видовые различия гемоглобина связаны со строением глобина.

Основная функция гемоглобина – обратимое связывание молекулярного кислорода и доставка его во все клетки организма и связывание углекислого газа в тканях и его транспортировка к легким. В состоянии покоя в крови растворяется до 200 мл кислорода в минуту. При сильных физических нагрузках количество растворенного кислорода увеличивается в 10 раз до 2-3 л в минуту. В среднем грамм гемоглобина поглощает до 1,34 мл кислорода.

Гемоглобин – представитель гемопротеинов, т.е. группы сложных белков. Молекула его состоит из четырех субъединиц – двух α и двух β- субъединиц. Полипептидная цепь каждой из субъединиц специфическим образом уложена вокруг большого плоского железосодержащего гема. Все четыре цепи гемоглобина сходны между собой по форме. Форма и функция гемоглобинов различных животных сходны, однако аминокислотный состав их различается и тем сильнее, чем дальше эволюционно они удалены друг от друга.

Гем только в связи с нативным глобином способен лабильно связывать кислород. При поглощении кислорода β-цепи гемоглобина сближаются, при отдаче его – расходятся. Положение α-цепей при этом не меняется. Следовательно, присоединение и отдача кислорода молекулой гемоглобина сопровождается изменением его структуры, что приводит к изменению спектра поглощения гемоглобина. Присоединив молекулу кислорода, гемоглобин переходит в оксигенированную форму (HbO 2 ) [2.503,585].

При присоединении к молекуле гемоглобина углекислого газа образуется карбоксигемоглобин. Таким образом, углекислый газ переносится от тканей к легким. Если на гемоглобин подействовать сильными окислителями (оксидами азота, парами нитробензола и другим сильными окислителями) он превращается в метгемоглобин (HbOH). В метгемоглобине железо находится в трехвалентном состоянии, в то время как в восстановленном и в оксигенированном гемоглобине – в двухвалентном. Метгемоглобин вне организма образуется при длительном выдерживании на воздухе растворов оксигемоглобина. Каждая форма гемоглобина характеризуется определенным спектром поглощения, представляющим собой зависимость оптической плотности раствора гемоглобина от длины волны света.

По литературным данным наиболее интенсивной полосой в спектре поглощения гемоглобина является полоса Соре, принадлежащая порфириновой части его молекулы. По изменению положения и интенсивности поглощения этой полосы можно судить о структурных изменениях молекул различных форм гемоглобина (таблицу 1).

Спектры поглощения различных форм гемоглобина применяются в клинической практике при выявлении отравлений у человека и животных, а также в судебной медицинской и ветеринарной практике.

Таблица 1- Спектральные характеристики различных форм гемоглобина человека

источник

4.2 Разложение УФ-спектров светопоглощения производных гемоглобина на составляющие поглощения апобелка и простетических групп

Способность гемоглобина связывать различные лиганды и аддукты как простетическими группами, так и апобелковой компонентой, делает эту макромолекулу удобной моделью при решении ряда биофизических, биохимических и физиологических задач [27, 36, 77, 81, 137].

Переменная валентность комплексообразователя и вариабельность аминокислотного состава субъединиц данного гемопротеида позволяют качественно расширить диапазон проводимых исследований, а известная пространственная структура этого белка дает возможность корректно верифицировать предлагаемые модели состояний как интактной макромолекулы, так и при воздействии на нее целого ряда физико-химических агентов, в т.ч. УФ- излучения.

Таким образом, молекула гемоглобина является уникальной структурно­функциональной моделью, как в молекулярной биофизике, так и в спектрофотометрии белков.

Исходя из формализованных представлений: «общий апобелок-различное состояние гема»/«различный апобелок-одинаковое состояние гема» представляется возможным исследовать, насколько аддитивна система

«апобелок/простетические группы» (A+B) как модель интегрального спектра поглощения макромолекулы (С).

С учетом вышеизложенного, нами было выполнено разложение спектров поглощения макромолекул наиболее значимых в физиологическом отношении производных гемоглобина A и F на составляющие компоненты уровня: «апобелковая/небелковая части биополимера». Кроме этого, были смоделированы спектры поглощения производных гемоглобина путем комбинирования различных небелковых и апобелковых компонент, полученных на предыдущем шаге исследований.

В качестве отправной точки были использованы полученные ранее спектры поглощения производных гемоглобина, а также аддитивные модели апобелка, созданные на основе спектров светопоглощения свободных аминокислот (см. 3.2, табл. 4), протокол эксперимента — вариант «В»).

На рис. 37 показана зависимость коэффициента корреляции от шага смещения по второй производной модельного спектра апобелка (A0) относительно нативного окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина A по аргументу v (кривая 1, 2, 3 и 4 соответственно). Такое смещение выполняли для каждой из 4 пар спектров поглощения C/A0 индивидуально.

Рис. 37. Зависимость коэффициента корреляции от Av дифференцированного модельного спектра апобелка относительно такового для производных гемоглобина A

Обозначения: оксигемоглобин (1), карбоксигемоглобин (2),

дезоксигемоглобин (3) и метгемоглобин (4); r — коэффициент корреляции

Примечание: протокол эксперимента — вариант «B»

Как следует из представленных данных (рис. 37), для всех пар спектров поглощения (C/A1) Av=-271,7 см -1 практически полностью (с точностью до цены деления дискретной шкалы в 27,17 см -1 ) совпадает с ранее полученным результатом, выполненным по данным протокола эксперимента вариант «А» (т.е. -298,7 см -1 , рис. 32).

Однако коэффициент корреляции Пирсона для пары спектров «дезоксигемоглобин/модель его апобелка» существенно ниже и обособлен своей величиной относительно аналогичных пар для окси-, карбокси- и метгемоглобина А.

Из этого следует, что разрешаемая тонкая структура спектров поглощения гембелка, обнаруживаемая по второй производной, не обязательно соответствует, а в данном случае, и казалось бы, противоречит результатам анализа недифференцированных спектров. Вместе с тем, предложенный метод контроля степени соответствия аддитивной модели к нативным спектрам белка позволяет оценивать также и степень сходства спектров производных гемоглобина между собой.

Таким образом, общая исходная модель апобелка (A0) может выступать как тест в оценке степени соответствия спектров производных гемоглобина друг к другу. Естественно, такое соответствие может быть установлено и непосредственно между этими производными гембелка путем корреляционного анализа по их дифференцированным спектрам поглощения. Другими словами, демонстрируемая особенность сопоставления исходного и модельных спектров при оптимизации шага смещения аддитивной модели является «полезным побочным эффектом», с помощью которого решаются две задачи: основная — поиск оптимума Av и вспомогательная — оценка степени соответствия спектров поглощения друг к другу.

Мы разложили на апобелковую и небелковую составляющие спектры

в,

Рис. 38. Спектры поглощения производных гемоглобина A в диапазоне длин волн 250,0-300,0 нм

Обозначения: оксигемоглобин (1), карбоксигемоглобин (2),

дезоксигемоглобин (3) и метгемоглобин (4); е — молярный показатель поглощения

Примечание: протокол эксперимента — вариант «B»

поглощения окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина A предложенным нами способом. В качестве интерполирующей функции выступил примененный ранее полином Чебышева первого рода 10 порядка. Коэффициент достоверности аппроксимации к интерполируемым спектрам В1 для HbO2, HbCO, Hb и MtHb составил соответственно: 99,958 %, 99,978 %, 99,955 % и 99,978 %.

На рис. 39-42 приведены модели спектров поглощения простетических групп для окси-, карбокси-, дезокси- и метформ гемоглобина A, а также апобелковых компонент в составе этих макромолекул (кривая 1, 2, 3 и 4 соответственно).

В табл. 10 указаны молярные показатели максимумов поглощения интегральных нативных (C) и модельных спектров апобелковой (A) и небелковой компонент (B) для HbO2, HbCO, Hb и MtHb.

Таблица 10. Максимумы поглощения и их молярные показатели для некоторых производных гемоглобина A
ОбразецABC
л max8л max8л max8
Оксигемоглобин278,048984269,290215274,6137172
Карбоксигемоглобин278,248951266,4109342269,0152949
Дезоксигемоглобин278,649272269,0119262
Метгемоглобин278,248852268,8118463

Примечание: A — модель спектра поглощения апобелка, B — простетических групп, C — интегральный нативный спектр макромолекулы; Xmax — максимум поглощения (нм), s — молярный показатель поглощения (л/(мольсм))

Следует отметить, на наш взгляд, важный аспект при оценке положения максимумов в недифференцированных спектрах поглощения белков.

Как следует из представленных данных (рис. 39-42), в спектрах карбокси-, дезокси- и метгемоглобина положение максимумов поглощения определяется одним из пиков боковой группы фенилаланина, который представляется локальным экстремумом (табл. 10, столбец C). Этот пик соответствует полосе №13 (см. 3.1, табл. 2) для спектров, дифференцированных по второй производной.

240 250 260 270 280 290 300 310 X, НМ

Рис. 39. Спектры поглощения оксигемоглобина A, его апобелковой и небелковой компонент в диапазоне длин волн 240,0-320,0 нм

Обозначения: спектр поглощения белка (1), модельный спектр поглощения гемовой компоненты и апобелка (2 и 3 соответственно); s — молярный показатель поглощения

Примечание: отмеченные пики поглощения определены из

недифференцированных спектров; протокол эксперимента — вариант «B»

240 250 260 270 280 290 300 310 X, НМ

Рис. 40. Спектры поглощения карбоксигемоглобина A, его апобелковой и небелковой компонент в диапазоне длин волн

240 250 260 270 280 290 300 310 X, НМ

Рис. 41. Спектры поглощения дезоксигемоглобина A, его апобелковой и небелковой компонент в диапазоне длин волн

Так как нахождение максимума поглощения осуществляется по поиску наибольшего значения по оси ординат (как формальный, простой и доступный в оценке критерий), то в некоторых случаях возможны неопределенности при соотнесении абсциссы для такого экстремума. Особенно, если суперпозиция формирующих этот максимум полос поглощения создает диффузный, с большой полушириной и локальными неоднородностями, пик.

Следовательно, незначительное снижение степени экспонирования или небольшие сдвиги в соотношении количества аминокислотных остатков, могут привести к смене приоритета при выборе максимума, что может выглядеть как определенное смещение его положения на недифференцированном спектре.

Это хорошо подтверждается, например, данными по найденным пикам поглощения апобелка (табл. 10, столбец A). Аналогичные эффекты отмечались ранее (см. 3.3, рис. 25-а) при анализе спектров поглощения альбумина.

Однако в хромопротеидах, в частности в гемоглобине, отмеченный эффект усиливается тем, что изменения в спектрах поглощения собственно простетических групп способны дать существенное расхождение в оценке положения соответствующих экстремумов в интегральных спектрах светопоглощения данных белков.

Так, для оксигемоглобина A пик поглощения определяется при длине волны 274,6 нм, что значимо больше по положению на абсциссе (>5 нм) относительно других форм гембелка. Но из этого не следует, что апобелковая компонента претерпела существенные спектральные модификации (рис. 39-42, табл. 10, столбец A), например, при замещении в гемовых группах одного лиганда на другой (в частности, O2 на CO).

То есть, значимая роль простетических групп при оценке положения максимумов интегральных спектров определяется, прежде всего, их высокими молярными показателями поглощения в широком диапазоне длин волн, даже если эти группы имеют пики с большой полушириной или отсутствуют совсем.

Таким образом, поиск максимумов в интегральных спектрах поглощения белков в ряде случаев сопряжен с неустойчивым решением по определению положения экстремума, а найденный максимум не всегда может корректно отражать структурные изменения хромофоров белка (особенно, если он представлен, как «макропоказатель» только лишь табличным значением). Использование методов производной спектрофотометрии позволяет снизить эту неопределенность.

Несущественное расхождение молярных показателей поглощения для гемоглобина (протокол эксперимента — вариант «A») и очищенного и скорректированного на примеси оксигемоглобина A (вариант «B», табл. 10) обусловлено, преимущественно, присутствием в исходном образце гемоглобина других его форм (см. 3.1). Отмечаемое небольшое несоответствие показателей поглощения связано также с различающимися методиками определения концентрации гембелка (см. 3.1, табл. 1).

Кроме этого, при оценке концентрации гемоглобина в клинико­диагностической лаборатории референтным метгемоглобинцианидным методом допускается погрешность измерения в 5 %, при этом ошибка соответствия фактической концентрации коммерческих калибровочных растворов цианметгемоглобина паспортным значениям эталона для различных партий, может доходить до 2 % [65].

Таким образом, различие показателей в пиках поглощения интегрального спектра, моделей спектров гемовой и апобелковой компонент оксигемоглобина A (вариант «B») относительно общего гемоглобина (вариант «A») составило соответственно: -4,53 %, -7,15 % и 0,65 %, что является вполне приемлемым результатом, позволяющим соотносить полученные данные по разным протоколам измерения.

На рис. 43 показано относительное поглощение гемовой компоненты для окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина A в зависимости от длины волны (240,0-320,0 нм). Интегральная относительная доля поглощения простетических групп в заданном диапазоне для этих гемпроизводных составила: 77,5 %, 77,9 %, 75,7 % и 73,7 % соответственно.

Как следует из представленных данных, минимальная доля поглощения

Рис. 43. Составляющая поглощения простетических групп производных гемоглобина A в диапазоне длин волн 240,0-320,0 нм

Обозначения: оксигемоглобин (1), карбоксигемоглобин (2),

дезоксигемоглобин (3) и метгемоглобин (4); ш, % — относительная доля поглощения небелковой компоненты в спектрах производных гемоглобина

гемовой составляющей в нативном спектре гембелка соответствует значениям не ниже 55 % (MtHb, Х-284 нм). Причем оценка по интегральной относительной доле (ю) дает еще большее минимальное значение — 73,7 % (MtHb).

Сопоставляя полученные результаты, следует отметить близкие величины для окси- и карбоксигемоглобина (разница менее 0,4 %), т.е. интегралы площадей поглощения практически одинаковы. Причем, существующая разность в долях светопоглощения между максимальным и минимальным значениями исследуемых форм гембелка не превышает 4,2 % (SHbCO-SMtHb).

Мы оценили, насколько коррелируют полученные результаты вычислений спектров поглощения простетических групп с экспериментальными данными. Для этого связали модельные спектры поглощения гемов (B, 240,0-320,0 нм) со спектрами поглощения нативных молекул белка (C, 320,0-380,0 нм), где поглощает только небелковая компонента (рис. 44). Как следует из представленных данных, модельные и экспериментальные спектры, принадлежащие разным диапазонам, гармонизируют между собой по наличию/отсутствию максимумов, амплитуде и выраженности пиков. В совокупности это также подтверждает корректность выполненных расчетов в рамках предложенного способа разложения спектров поглощения.

Представляется интересным получить спектры поглощения апобелковых компонент хромопротеидов с различным аминокислотным составом путем вычитания из полученного экспериментального спектра C вычисленного модельного спектра B, если, разумеется, совпадают небелковые компоненты, в частности, по таким показателям как степень окисления и тип лиганда для комплексообразователя.

Кроме этого, появляется возможность проверить, насколько аддитивна предлагаемая модель (см. 4.1, уравнение (28)). Для этого было выполнено разложение спектра поглощения оксигемоглобина F.

На рис. 45 показана зависимость коэффициента корреляции от шага смещения по второй производной модельного спектра апобелка A и F (A0) относительно нативного оксигемоглобина A и F (C) по аргументу v. Для HbFO2

Рис. 44. Спектры поглощения производных гемоглобина A и его моделей: спектров простетических групп

Обозначения: дезоксигемоглобин (1), метгемоглобин (2),

оксигемоглобин (3) и карбоксигемоглобин (4); вертикальная пунктирная линия делит диапазон поглощения гемовых групп на вычисленные (слева) и экспериментальные (справа) области полученных данных; по оси ординат — поглощение (A)

Примечание: спектры поглощения смещены друг относительно друга по оси ординат на константу; протокол эксперимента — вариант «B»

Рис. 45.Зависимость коэффициента корреляции от Av дифференцированного модельного спектра апобелка относительно такового для оксигемоглобина A и F

Обозначения: оксигемоглобин A (1) и оксигемоглобин F (2); r — коэффициент корреляции

значение Av составило -190,2 см -1 , что на -81,5 см -1 отличается от HbAO2.

Наблюдаемое расхождение Av и r обусловлено различиями в тонкой структуре спектров поглощения оксигемоглобина F и A (выявляемой с помощью второй производной). Так как коэффициент корреляции (в отличие от ковариации) не зависит от размерности величин сравниваемых массивов, то и значение r также не определяется величиной поглощения (как, например, функцией от концентрации) для сравниваемых спектров.

Подобное различие по коэффициенту корреляции также наблюдалось и ранее при сопоставлении данных по окси-, карбокси- и метформе белка относительно дезоксиформы (рис. 37 и 38, см. также 3.1).

На рис. 46 показаны в сравнении между собой спектры поглощения оксигемоглобина F и A (кривая 1 и 2 соответственно), модели спектров поглощения гемовой (кривая 3 и 4) и апобелковой (кривая 5 и 6) компонент.

Для оксигемоглобина F максимумы поглощения составили: 273,6 нм (s=145911, спектр нативного белка), 268,6 нм (s=91023, модель спектра гемовой составляющей) и 278,4 нм (s=57148, модель спектра поглощения апобелка).

Относительная доля поглощения простетических групп оксигемоглобина F (кривая 1) и A (кривая 2) в диапазоне длин волн 240,0-320,0 нм представлена на рис. 47. Интегральная относительная доля поглощения простетических групп этой формы гембелка составила 74,3 % (против 77,5 % для HbAO2, т.е. A=-3,2 %).

Сопоставляя положение максимумов недифференцированных спектров поглощения моделей апогемоглобина A и F, следует отметить (табл. 10) незначительное +0,4 нм (относительно HbAO2) смещение экстремума.

С одной стороны, это смещение объясняется хотя и небольшими, но неизбежными, сопряженными с выбранным алгоритмом разложения спектра поглощения, артефактами, а также случайными ошибками, обусловленными, в том числе, погрешностями определения показателей светопоглощения для спектров белков и свободных аминокислот, входящих в аддитивную модель.

С другой стороны, такое смещение обусловливается характером и выраженностью волнового сдвига для различных по типу боковых групп

240 250 260 270 280 290 300 310 X, НМ

Рис. 46. Сравнительные спектры поглощения оксигемоглобина F и A, их апобелковой и небелковой компонент в диапазоне длин

Обозначения: спектр поглощения гемоглобина F и A (1 и 2), модельный спектр поглощения гемовой компоненты F и A (3 и 4) апобелка (5 и 6 соответственно); в — молярный показатель поглощения

Примечание: отмеченные пики поглощения определены из

недифференцированных спектров; протокол эксперимента — вариант «B»

Рис. 47. Составляющая поглощения простетических групп гемоглобина F и A в диапазоне длин волн 240,0-320,0 нм

Обозначения: оксигемоглобин F (1) и A (2); ш, % —

относительная доля поглощения небелковой компоненты в спектрах производных гемоглобина

аминокислот в составе макромолекулы, прежде всего тирозина и триптофана. Так, из-за различного шага смещения пиков поглощения аминокислотных остатков при изменении соотношения последних в нативной макромолекуле спектр светопоглощения апобелковой составляющей будет претерпевать определенные модификации. Даже в «чистом» эксперименте (см. 3.2, табл. 4), изменение соотношения количества аминокислот приводит к сдвигу пиков полос поглощения в аддитивной модели апобелка.

Из этого следует, что при оценке положения максимумов в недифференцированных спектрах возможны неопределенности в соотнесении их к оси абсцисс, что было рассмотрено нами ранее.

Так как спектр небелковой составляющей «комплементарен» апобелковой части макромолекулы (исходя из модели, лежащей в основе алгоритма разложения спектров поглощения как двухкомпонентной системы), то для гемовой части HbFO2 также наблюдаются некоторые отличия в положении максимума и его интенсивности относительно HbAO2. Однако такие отличия для размытого пика несущественны как по положению (-0,6 нм против HbAO2), так и по интенсивности (максимальная относительная разность для любой комбинации: отношение пиков при соответствующих Xmax, отношение при одной длине волны для любого из них, не превышает 1 %).

Таким образом, некоторое несоответствие модельных спектров поглощения гемовой компоненты для оксигемоглобина A и F скорее всего подчеркивает особенности микроокружения аминокислотных остатков и характер волнового сдвига для последних, что, однако, не является препятствием при построении базовых моделей спектров. Причем, такие несоответствия также могут нести в себе дополнительную информацию о структуре и спектральных свойствах молекулы белка (см. следующую главу).

Исходя из этого, становится возможным, опираясь на принцип аддитивности, смоделировать, как минимум в первом приближении, спектры поглощения окси-, карбокси-, дезокси- и метгемоглобина (рис. 48). Нами построены модели спектров поглощения гемоглобина F(*), где апобелковая

в,

Рис. 48. Модели спектров поглощения гемоглобина F в диапазоне

Обозначения: карбоксигемоглобин* (1), оксигемоглобин* (2),

дезоксигемоглобин* (3) и метгемоглобин* (4); в — молярный показатель поглощения

Примечание: апобелковая компонента получена путем разложения спектра оксигемоглобина F, простетические группы — спектров производных гемоглобина A; знаком «*» обозначены модели спектров; протокол эксперимента — вариант «В»

компонента была получена разложением спектра HbFO2, а гемовая компонента — разложением производных гемоглобина A (HbFCO* — Хтш=269,0 нм, HbFO2* — ^max=273,8 нм, HbF* Xmax=268,6 нм, MtHbF* lmax=269,0 нм).

Соответственно, модельный спектр HbAO2(*) также был получен аналогичной перегруппировкой апобелковой и гемовой компонент (рис. 49).

Таким образом, практически полное (ограниченное только лишь наличием примесей и случайной ошибкой измерения) совпадение спектров поглощения одинаковых по состоянию небелковой компоненты производных гемоглобина A и F (а фактически, именно простетических групп) в видимом диапазоне длин волн [171] распространяется и на диапазон, где происходит перекрытие светопоглощения гемов с апобелковой частью макромолекулы.

Это позволяет (как минимум, в первом приближении) рассматривать спектр поглощения гембелка в УФ-диапазоне длин волн как сумму спектров поглощения небелковой и апобелковой компонент.

Однако из наблюдаемой «спектральной» аддитивности для системы «небелковая/апобелковая компоненты» однозначно не следует аддитивность по другим оценочным критериям, т.к. такой «спектральный» вид аддитивности представляет собой следствие скоррелированности изменений в спектрах поглощения только лишь одной компоненты — гема в УФ- и видимом диапазонах спектра.

То есть, отсутствие подобной корреляции между видимым участком спектра гембелка и УФ-спектром поглощения простетических групп указывало бы и на соответствующее отсутствие аддитивности между апобелковой и небелковой компонентами (что, однако, не подтверждается нашими экспериментами).

Это означает, что данное качество позволяет оценивать модификации в апобелковой компоненте, в т.ч., и по изменению спектров поглощения гембелка в видимом диапазоне длин волн, а также рассматривать модели спектров светопоглощения соответствующих небелковых компонент как универсальное слагаемое для других форм биополимера, различающихся по апобелку (например,

в,

Рис. 49. Спектры поглощения нативного оксигемоглобина F и A, модели этих спектров в диапазоне длин волн 240,0-320,0 нм

Обозначения: спектр поглощения нативного оксигемоглобина F (1), A — (2), модель спектра поглощения оксигемоглобина F* (3), A* — (4); е — молярный показатель поглощения

Примечание: модели спектров поглощения (обозначены знаком «*») получены рекомбинацией небелковых составляющих гембелка A и F в его оксиформе; протокол эксперимента — вариант «В»

гемоглобины A2, P: Gover 1 и 2, Portland I и II, а также S, С и т.п.).

Строго говоря, рассматриваемая нами аддитивность апобелковой и небелковой составляющей не является в известном смысле таковой из-за того, что спектр поглощения изолированного гема не аддитивен по отношению к спектру изолированного апобелка прежде всего из-за качественных отличий спектров свободной и интегрированной в макромолекулу небелковой компоненты (см. 4.1).

Другими словами, изолированные компоненты (прежде всего гемовые группы) спектрально не соответствуют соответствующим компонентам в составе макромолекулы, и поэтому аддитивность классическим способом не может быть физически подтверждена. Однако она может быть выявлена с помощью предложенного нами способа разложения спектров и рекомбинирования между собой апобелковой и гемовой составляющей по одинаковой лигандной форме гемоглобина A и F.

Следует также сказать, что из отмечаемой нами аддитивности в системе «небелковая/апобелковая компонента» вовсе не следует такая же аддитивность субкомпонент в апобелковой составляющей. Кроме этого, консервативность спектров поглощения апобелка при изменении состояния гемовой компоненты в рамках используемых моделей (точности ее аппроксимации) также поставлена под сомнение (см. 3.1, 4.2).

В заключение следует отметить, что, вероятно, спектральные модификации гемовой компоненты при изменении степени окисления или лигандирования комплексообразователя не взаимосвязаны напрямую с таковыми изменениями для апобелка. Однако они координированы через конформационные перестройки макромолекулы, как следствие приводящей к изменению микроокружения боковых групп аминокислот апобелка. Это представление хорошо соотносится с данными рентгеноструктурного анализа [144] и расчетов, выполненных с помощью различных методов компьютерной симуляции [59].

Особенности спектральных модификаций апобелковой компоненты гембелка при изменении лигандирования или степени окисления комплексообразователя, а также результаты исследований тонкой структуры спектров небелковой компоненты в исследуемом диапазоне длин волн будут рассмотрены в следующей главе.

источник